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Jul 09, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12619 (2023) Citar este artículo

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Una estrategia para combatir la resistencia a los antimicrobianos es el descubrimiento de nuevas clases de antibióticos. La mayoría de los antibióticos en algún momento interactuarán con la membrana bacteriana para interferir con su integridad o cruzarla. Por lo tanto, las herramientas confiables y eficientes para determinar la constante de disociación para la unión a la membrana (KD) y el coeficiente de partición entre las fases acuosa y de membrana (KP) son herramientas importantes para descubrir y optimizar los ataques antimicrobianos. Aquí demostramos que la termoforesis a microescala (MST) se puede utilizar para la medición de KD sin etiquetas utilizando la fluorescencia intrínseca del triptófano y eliminando así la necesidad de etiquetado con cromóforo. Como prueba de principio, hemos utilizado el método para medir la unión de un conjunto de pequeños AMP cíclicos a grandes vesículas unilaminares (LUV) y dos tipos de nanodiscos lipídicos ensamblados por ácido estireno maleico (SMA) y amonio cuaternario SMA (SMA-QA). ). Los valores de KD medidos se correlacionan bien con las mediciones correspondientes utilizando resonancia de plasmón superficial (SPR), y también reflejan ampliamente la concentración de inhibición mínima (MIC) de los AMP probados hacia S. aureus y E. coli. Concluimos que MST es un método prometedor para la detección rápida y rentable de interacciones péptido-lípidos o el mapeo de las condiciones de la muestra en preparación para estudios más avanzados que dependen de una costosa preparación de muestras, etiquetado y/o tiempo de instrumentos.

Los péptidos antimicrobianos (AMP) han atraído cada vez más atención como fuente de inspiración para combatir la inminente crisis de resistencia a los antimicrobianos a medida que el descubrimiento de nuevas clases de antibióticos se ha detenido1. Los AMP son una clase de péptidos que tienen actividad antimicrobiana, aunque también se sabe que poseen algunas propiedades antifúngicas y anticancerígenas2,3. Por lo general, son péptidos catiónicos cortos de aproximadamente 12 a 50 aminoácidos, y generalmente se requieren al menos 4 residuos para la actividad4. Se encuentran en la mayoría de los organismos vivos y son componentes naturales e indispensables de las defensas inmunes innatas5,6,7,8. Actualmente, más de 20.000 secuencias peptídicas con propiedades antimicrobianas están publicadas en depósitos específicos9,10,11,12,13, lo que proporciona un conjunto de posibles candidatos terapéuticos. El modo de acción antimicrobiano de la mayoría de los AMP parece ser apuntar a la integridad y/o el potencial eléctrico de la bicapa de la membrana, o tener múltiples objetivos y combinaciones de modos de acción, algo que hace que la resistencia sea más difícil de desarrollar y viene con un mayor costo de mantenimiento de la condición física. Salvo algunas excepciones, esto contrasta con los antibióticos tradicionales, que suelen tener un objetivo bien definido. Una segunda ventaja de los AMP es que no es necesario cruzar completamente la membrana, ya que los péptidos activos en la membrana a menudo ejercen sus actividades alterando, permeabilizando o lisando la propia membrana bacteriana14,15.

La afinidad de AMP hacia las membranas bacterianas a menudo se describe de dos maneras: como un evento de unión que puede describirse mediante la constante de disociación KD16; o como un sistema bifásico, donde la interacción del AMP con los lípidos se considera una partición entre una fase lipídica y una fase acuosa, caracterizada por la constante de partición KP17. Por tanto, tanto KD como KP son descriptores útiles para seleccionar compuestos en función de sus interacciones con la membrana bacteriana objetivo.

Los métodos actuales utilizados para evaluar la afinidad de los lípidos suelen adolecer de varias desventajas. Es posible que no sean aplicables a uniones más fuertes (RMN)18, requieran un etiquetado que afecte la unión (ensayos de fluorescencia)19, requieran mucho tiempo (RMN y SPR)20,21, exijan grandes cantidades de muestras (RMN) o requieran ajustes para cada compuesto individual (SPR e ITC)20,21. La termoforesis a microescala (MST) es un método que no presenta estas desventajas22. Es una herramienta simple pero poderosa que permite la determinación de los parámetros de unión mediante la observación de los efectos de la unión en un fluoróforo y en las propiedades termoforéticas relativas de los complejos formados. Las uniones se obtienen monitoreando los cambios en la intensidad de fluorescencia de un complejo a lo largo del tiempo tras la exposición a un láser IR. El láser calienta una serie de muestras con diferentes concentraciones de ligando, provocando una redistribución de las moléculas según sus energías de Gibbs relativas en solución a las diferentes temperaturas (termoforesis). Los cambios en la fluorescencia debidos a los efectos de unión del ligando se controlan al calentar y volver a enfriar. El método es sensible a cambios en el pliegue, la forma, la capa de solvatación, la carga o el tamaño general del complejo unido al ligando. Estos cambios pueden afectar el ambiente local de un fluoróforo al alterar la extinción dinámica y estática, así como las propiedades termoforéticas del complejo, y hacer que MST sea sensible a cambios potencialmente menores en las propiedades que surgen de la unión23. Actualmente, la MST se utiliza principalmente para evaluar interacciones biomoleculares, incluida la unión de ligandos a diversos sustratos22 y la polimerización24. Una aplicación anterior relacionada de MST por Yu et al. evaluaron la unión de un AMP utilizando el etiquetado FITC25. La MST se puede realizar mediante etiquetado con fluoróforo o sin etiquetas, aprovechando los aminoácidos intrínsecamente fluorescentes como W, Y y F. La casi ubicuidad de W en muchos AMP brinda la oportunidad de estudiar las propiedades de unión de AMP directamente mediante la utilización de la fluorescencia intrínseca de W. Otras ventajas importantes de la MST son los bajos requisitos de muestra, los tiempos de medición cortos y la configuración experimental sencilla20,21,26.

Aquí demostramos que MST es un método viable para la determinación rápida y sin etiquetas de la afinidad de AMP hacia las bicapas lipídicas. Utilizamos MST sin etiquetas para estudiar cinco hexapéptidos antimicrobianos cíclicos (Fig. 1) y sus uniones a tres sistemas lipídicos, comparando los resultados con los datos de SPR sobre la unión a vesículas lipídicas.

Estructuras de los cinco AMP Coloreadas en rojo/naranja: R/K, azul: W. Las letras mayúsculas indican l-aminoácidos, las letras minúsculas indican d-aminoácidos.

Los AMP 1 a 4 se seleccionaron en base a un farmacóforo previamente establecido de distribución alterna versus agrupada de restos cargados e hidrofóbicos27,28,29,30,31, donde se muestra que la agrupación de W y residuos cargados se correlaciona positivamente con la actividad antimicrobiana4. Se confirmó que los AMP 1 a 4 tienen actividad antimicrobiana (Tabla 1) y son una combinación de residuos W alternados y agrupados con residuos R o K. Se incluyó AMP 5 como control negativo, ya que era inactivo contra las cepas bacterianas analizadas (Tabla 1) y mostraba una pobre preferencia lipófila.

Los tres sistemas lipídicos diferentes que se seleccionaron para el estudio fueron vesículas unilaminares grandes (LUV), nanodiscos de estireno-ácido maleico (SMA)32 y nanodiscos de estireno-ácido maleico funcionalizados con nanodiscos de amonio cuaternario (SMA-QA)33. Los diferentes sistemas se eligieron para investigar tanto la idoneidad de diferentes modelos de lípidos para la aplicación de MST y la unión de lípido-AMP como el impacto que la elección del sistema modelo puede tener en la unión. Se eligieron nanodiscos y vesículas de SMA porque se habían utilizado previamente en MST23,34, y se pudieron investigar los efectos de las diferencias en la curvatura de la superficie. Se seleccionó SMA-QA porque posee una correa de polímero catiónico, en contraste con SMA que tiene una correa aniónica.

Como se sabe que la atracción electrostática de los AMP catiónicos y los lípidos aniónicos mejora sus interacciones, se evaluó la asociación de los AMP tanto con DMPC puro como con una mezcla de 95% de DMPC y 5% de PG en cada uno de los tres sistemas lipídicos. Finalmente, se utilizó SPR como método ortogonal con el que se podían comparar las uniones derivadas de MST.

SPR investigó por primera vez las interacciones entre los AMP 1 a 5 y los LUV como punto de referencia para las mediciones de MST. Los datos se adquirieron utilizando las mismas composiciones de lípidos que se utilizaron en la adquisición de datos de MST. Los LUV se inmovilizaron en un chip L1 y se inyectó sobre ellos una concentración cada vez mayor de AMP. La Figura 2 muestra ajustes típicos en estado estacionario de las mediciones de SPR, y las constantes de disociación y partición, KD y KP, extraídas después de 180 s se enumeran en las Tablas 3 y 4. La tasa de disociación, koff, se calculó a partir del paso de disociación, utilizando la metodología presentada por Figueira et al.21, resumida en la Tabla 2.

Relación de RU (señal peptídica) y RUL (bicapa lipídica) obtenida en estado estacionario utilizando SPR para (A) LUV 100% DMPC. (B) 95% DMPC 5% DMPG LUV. El diagrama de dispersión presenta los valores experimentales y la línea completa representa el ajuste obtenido de la ecuación. (2). Los sensogramas completos están disponibles en el depósito abierto de datos de investigación de la UiT35.

SPR mostró valores para KD, KP y koff en el rango de 50–800 μM, 1–150 10−3 y 0,2–1,0 s−1 respectivamente. 1 fue el compuesto de unión más fuerte, seguido de 3, 2 y 4, siendo el AMP 5 inactivo el más débil. Esta tendencia también se mantuvo cuando estaban presentes lípidos aniónicos, pero como se esperaba, las afinidades generales de todos los compuestos aumentaron. Los valores de koff también siguieron esta tendencia, siendo el AMP más activo, 1, el que tuvo la disociación más lenta. La conclusión general de SPR apunta hacia una mayor afinidad de los péptidos agrupados sobre los alternos hacia las bicapas lipídicas iónicas y zwitteriónicas.

Para la evaluación de KD mediante MST, se registró FHot durante la fase de cambio de intensidad relacionada con la temperatura (TRIC) del trazo de MST (ver "Métodos"). La ventaja de evaluar KD durante la fase TRIC es que se puede evitar cualquier efecto potencial del calentamiento prolongado sobre la termoestabilidad de la muestra que pueda influir en la unión36. El perfil dosis-respuesta de la respuesta de MST frente a la concentración de lípidos de 1 a 5 sigue en gran medida una forma de curva sigmoidea (Fig. 3A, B). En los casos de 5 y 4, la unión más débil resultó en el truncamiento de la curva sigmoidea, y la región asintótica con alta concentración de lípidos no se muestreó completamente.

Respuesta de MST contra la concentración de lípidos y ajustes KD promedio de 1 a 5 en diferentes composiciones de vesículas lipídicas. Los paneles superiores muestran vesículas de 100 nm. (A) 100 % DMPC. (B) 95% DMPC 5% DMPG. Los paneles inferiores muestran la respuesta MST en blanco. (C) 100 % DMPC. (D) 95% DMPC/5% DMPG. Las barras de error representan la desviación estándar de los triplicados.

Se recopiló una serie en blanco que constaba únicamente de lípidos para cada composición de lípidos y se pudo detectar una respuesta débil de MST en las concentraciones de lípidos más altas a pesar de la falta de un fluoróforo. La respuesta en blanco fue estable hasta concentraciones de alrededor de 1 mM. Sin embargo, las dos o tres concentraciones de lípidos más altas medidas generaron una respuesta de fondo por encima del nivel de ruido de la línea de base (Fig. 3C, D), muy probablemente debido al aumento de la turbidez. La respuesta inespecífica agregada a los dos últimos puntos de datos impone, por lo tanto, una limitación sobre cómo se pueden medir de manera confiable las interacciones débiles (rango de concentración de lípidos mM). Sin embargo, la turbidez no afectó notablemente la extracción de Fnorm en presencia de AMP (que transportan el fluoróforo), ya que la señal mucho más fuerte del fluoróforo no mostró ningún signo de heredar la contribución de turbidez a Fnorm del perfil en blanco (se muestran los datos sin procesar). en la figura S1). Esto sugiere que la fluorescencia W fue la contribución dominante a la respuesta medida cuando estuvo presente. Sin embargo, no es posible descartar que el efecto de dispersión de la luz pueda dominar la respuesta de aglutinantes muy débiles. El péptido 5, por ejemplo, muestra un cambio en Fnorm para los dos últimos puntos junto con los liposomas de DMPC, los mismos puntos que se ven afectados significativamente por los efectos de dispersión de la luz en la medición en blanco (Fig. 3A). Sin embargo, el efecto está ausente para el mismo péptido junto con liposomas DMPC:PG incluso aunque los dos espacios en blanco se comportan de manera similar, lo que demuestra que las posibles contribuciones a la dispersión de la luz son difíciles de predecir o compensar.

El hecho de que la dispersión de la luz esté presente en concentraciones de lípidos más altas puede generar preocupaciones de que la densidad de los lípidos podría potencialmente obstaculizar la termoforesis de los analitos en la muestra, incluso para especies que no interactúan. Sin embargo, como lo demostraron Yu et al.25, la respuesta MST de restos que no interactúan, demostrada con FITC, no se ve afectada hasta concentraciones de lípidos de 2,5 mM. Además, el muestreo de la respuesta de MST en la fase TRIC del trazo de MST significa que los efectos termoforéticos son menos dominantes, lo que minimiza el riesgo de artefactos causados ​​por los lípidos37.

Los datos de MST para dos tipos de nanodiscos, SMA y SMA-QA, se evaluaron utilizando la misma metodología que los datos de vesículas, con FHot tomado durante el TRIC y Fnorm representado frente a log[lípido] y ajustado a la ecuación. (6). Los perfiles de unión de AMP que se unen a nanodiscos SMA y SMA-QA muestran comportamientos significativamente diferentes (Fig. 4).

Respuesta de MST contra la concentración de lípidos y ajustes de KD de 1 a 5 en diferentes composiciones de nanodiscos de lípidos. Los paneles de la izquierda muestran nanodiscos SMA y los nanodiscos SMA-QA de la derecha que consisten en (A/E) 100% DMPC, (B/F) 95% DMPC/5% DMPG, (C/G) polímero (sin lípidos*), y nanodisco (D/H) únicamente (sin péptido). *Se utiliza [lípido] equivalente para estimar la cantidad de SMA que estaría presente en esa concentración de lípidos en los nanodiscos correspondientes. Las barras de error representan el rango por triplicado.

Los nanodiscos SMA-QA producen una curva de respuesta similar a sigmoidal (Fig. 4D, E), como se observó para las vesículas, aunque la curva se desplaza hacia la derecha a concentraciones de lípidos más altas, es decir, los AMP se unen más débilmente a SMA-QA. nanodiscos que a las vesículas correspondientes. La consecuencia del desplazamiento a la derecha es que las curvas de unión de los aglutinantes más débiles no se muestrean completamente y, en algunos casos, sólo se puede determinar una KD mínima. Al igual que con las vesículas, en las concentraciones más altas de lípidos, la dispersión de la luz puede convertirse en un factor en la medición de Fnorm. El resultado es que resulta poco práctico muestrear completamente la curva de unión aumentando aún más la concentración de lípidos, ya que se esperaría una mayor influencia de los efectos de dispersión de la luz.

Por el contrario, la respuesta de los nanodiscos de SMA se desplaza hacia la izquierda a concentraciones de lípidos más bajas, lo que corresponde a una unión más fuerte que a las vesículas correspondientes (Fig. 4A, B). Las curvas también se desvían del perfil sigmoidal Fnorm con una caída secundaria en Fnorm después de alcanzar el máximo, en el rango mM. Estos perfiles se han observado previamente en la respuesta MST de uniones estequiométricas superiores donde ligandos que interactúan adicionales dieron lugar a una nueva especie del complejo22. En el caso de las interacciones nanodisco-AMP, la explicación más plausible es que las interacciones directas entre 1 y 5 y el polímero SMA dan lugar a un perfil de unión atípico. De hecho, se puede observar una interacción directa entre el polímero SMA libre y los AMP en el rango alto de nM-bajo µM en un experimento de control sin lípidos presentes (Fig. 4C, G). La presencia de fuertes interacciones con el polímero SMA y un perfil de respuesta de múltiples fases indica que la interacción con el polímero domina la medición en la medida en que la interacción AMP-lípido no se puede medir directamente en nanodiscos SMA (Tabla 3). La fuerza de la interacción con el polímero SMA, junto con su papel en la estabilización del nanodisco, llevó a suponer que el sistema se vería significativamente perturbado. Por lo tanto, no se hicieron más intentos de desconvolucionar múltiples interacciones de estas curvas de respuesta.

La fuerte interacción con el polímero SMA se puede atribuir al rico contenido de ácido maleico aniónico (desprotonado a pH 7,4), lo que da como resultado interacciones electrostáticas favorables con los AMP catiónicos. En consecuencia, no se observa dicha unión para el polímero SMA-QA, que en cambio es rico en restos catiónicos y, por lo tanto, tiene el potencial de interacción electrostática atractivo para los AMP catiónicos reemplazado por un potencial repulsivo, que se refleja en que los perfiles de respuesta se desplazan hacia perfiles más débiles. vinculante.

La comparación de la KD derivada de MST y SPR para LUV muestra que la KD absoluta obtenida se compensa sistemáticamente con un factor aproximado de 4 (Fig. 5C, D y Tabla 3), pero los valores relativos dentro de cada conjunto de datos dan como resultado la misma estratificación de los péptidos. fuerza de unión a LUV medida por MST y SPR. El péptido inactivo 5 tenía una KD considerablemente mayor en comparación con el 1-4, aunque no se pudo muestrear completamente el perfil del 5. Por lo tanto, solo se determinó la KD mínima, lo que proporciona una explicación de por qué MST no identificó la misma fuerte dependencia de la composición lipídica que SPR para este péptido. De acuerdo con la SPR, los péptidos de secuencia agrupada 1 y 3 tenían una unión significativamente más fuerte que 4. Esto también es consistente con las CIM determinadas, siendo 1 y 3 los péptidos más activos. Estas observaciones están en línea con informes anteriores de que la agrupación de residuos de W se correlaciona positivamente con la actividad antimicrobiana4.

KD determinados por MST y SPR a DMPC (gris claro) y DMPC/PG (gris oscuro). (A) KD determinada usando nanodiscos SMA (blanco: polímero SMA), (B) KD determinada usando nanodiscos SMA-QA, (C) KD determinada usando vesículas de 100 nm, (D) KD determinada usando SPR y vesículas (extruidas a través de 100 nm filtrar). Las barras de error representan la desviación estándar de los triplicados.

La KD derivada de SMA-QA se compara favorablemente con los resultados de SPR en los casos en que la curva se muestrea adecuadamente (Fig. 5B, Tabla 3). Sin embargo, a medida que KD se acerca a la región mM, el conjunto de datos SMA-QA no se muestrea lo suficiente como para producir resultados confiables. Esto se expresa de manera más evidente como errores grandes, donde, al no alcanzarse un máximo en las concentraciones de lípidos muestreadas, el KD ajustado es sensible a valores atípicos y pequeñas desviaciones en la pendiente de la curva. Un ejemplo de muestreo insuficiente y el error resultante se muestra en la mala reproducción de la discriminación PC/PG observada en SPR para 2. Sin embargo, es importante destacar que cuando la curva se muestrea adecuadamente, el error KD es consistente con los errores MST informados por el usuario26.

Sin embargo, este no es el caso de los AMP más activos donde la fuerza de unión está dentro del rango de muestreo. Por lo tanto, los nanodiscos SMA-QA solo son viables para evaluar interacciones AMP-lípidos más fuertes que el rango mM mediante MST.

Los discos SMA exhiben fuerzas de unión sobreestimadas, mostrando que todos los péptidos tienen una KD aparente de 10 µM o menos (Tabla 3), y muestran una discriminación deficiente entre los lípidos PC y PC/PG (Fig. 5A). La falta de discriminación se atribuye a la fuerte interacción con el polímero aniónico SMA que domina la respuesta y enmascara la mejora de unión esperada por la adición de lípidos aniónicos.

En general, la presencia de lípidos PG conduce a una disminución de KD para todos los péptidos en un factor aproximado de 2 cuando se pudo muestrear completamente la curva de unión sigmoidea. En un trabajo publicado anteriormente, Christiaens et al.38 descubrieron que los péptidos individuales tenían una amplia gama de fuerzas de unión, desde una débil 350 µM hacia vesículas de PC, hasta una unión más fuerte en el rango bajo de µM-nM a vesículas ricas en cargas aniónicas. Al analizar los nanodiscos de MSP mediante ITC y RMN, Zhang et al.39 observaron la unión a nanodiscos de lípidos aniónicos en el rango de 1 a 2 µM. Por lo tanto, las KD medidas por MST están en línea con los resultados de la literatura que muestran que los AMP pueden unirse en el rango bajo de µM tanto a vesículas como a nanodiscos en presencia de lípidos aniónicos, con un debilitamiento esperado de la interacción hacia las membranas zwitteriónicas. Se sabe que los AMP catiónicos tienen selectividad hacia las membranas bacterianas donde los lípidos aniónicos y LPS están presentes en la membrana externa sobre las células con una superficie más neutra. Si bien la reducción de KD tras la introducción de lípidos aniónicos observada entre 1 y 5 no es tan grande como se describe en los estudios anteriores, el componente aniónico introducido en este trabajo (5%) es bajo en comparación con el 20% utilizado por Zhang et al. . y Christiaens et al.

La KD calculada en este trabajo se ajusta utilizando un modelo de dos estados40. Sin embargo, no se espera necesariamente que esto sea una representación precisa de las interacciones de los lípidos, donde el objetivo no tiene un sitio de unión definido, y es posible que se produzca autoagregación en la superficie del lípido, efectos de saturación y unión cooperativa o competitiva que influyan. la unión de más AMP41,42. Por esta razón, KD es un descriptor ilustrativo y comunicable útil de la unión de AMP a lípidos, pero se recomienda tener cuidado de no sobreinterpretar el valor absoluto. La KD aparente medida se considera mejor como un valor compuesto que representa múltiples procesos de una interacción compleja, que depende del sistema y del método, como también se destaca en este trabajo.

El coeficiente de partición (KP) describe la preferencia de los compuestos por las fases lipídica o acuosa, donde un KP alto indica una mayor preferencia por la fase lipídica. KD, por el contrario, describe el estado unido como un complejo molecular en lugar de una fase. Tanto KD como KP son descriptores útiles de las interacciones AMP-lípidos, y los instrumentos que pueden determinar ambos pueden ofrecer a los usuarios una gran flexibilidad para explorar las interacciones biofísicas. Para explorar la posibilidad de determinar el KP de los AMP 1 a 5 usando MST, se utilizaron las intensidades de fluorescencia de longitud de onda única medidas por el instrumento MST. Estos datos se adquieren de forma rutinaria durante las mediciones de MST durante la fase inicial del trazo de MST para su uso como medición de FCold y se informa como "fluorescencia inicial". Por tanto, no se requiere tiempo de adquisición adicional. Hasta donde sabemos, este es el primer intento de utilizar estos datos para determinar KP utilizando hardware MST. KP se extrajo ajustando los datos a una curva de partición hiperbólica descrita por la ecuación. (8), tras la eliminación de los puntos no hiperbólicos43.

Se recogieron blancos de lípidos únicamente para evaluar el efecto que tuvo la turbidez en las mediciones (Fig. 6). Para las vesículas, esta es una señal modesta que aumenta linealmente en el rango de concentración de lípidos mM. El aumento es consistente con la respuesta MST observada informada anteriormente (Fig. 3C, D), atribuida a los efectos de dispersión de la luz. Ambos tipos de nanodiscos SMA siguen de manera similar una tendencia mayoritariamente lineal, pero las señales son más intensas (Fig. 6).

Las intensidades fluorescentes medidas de las muestras de lípidos en blanco solo de nanodiscos y vesículas de SMA y SMA-QA.

La fluorescencia de fondo de las vesículas es modesta en las concentraciones iniciales en comparación con las intensidades de fluorescencia medidas del AMP y no tiene el mismo perfil a medida que aumenta la concentración de lípidos (Fig. S2). Se observa un mayor aumento para las concentraciones más altas de lípidos, lo que muestra la influencia de la turbidez del sistema (Fig. 6). La señal de fluorescencia de fondo inicial de los nanodiscos SMA-QA es significativamente más fuerte y se mantiene un nivel sustancial en el rango de concentración medido. Al igual que con las vesículas y los nanodiscos de SMA, el perfil de intensidad de la muestra de SMA-QA con AMP presente no coincide con el perfil cuando el AMP está presente (Fig. S2). Por este motivo, no es posible restar la línea base en blanco de la señal AMP. Por lo tanto, los puntos finales conllevan una mayor incertidumbre debido a las contribuciones potenciales, pero inconsistentes, de dispersión de la luz (Fig. 7 y Fig. S3).

Ajustes de fluorescencia inicial y KP de 1 a 5 en diferentes composiciones lipídicas de LUV. (A) 100 % DMPC. (B) 95% DMPC con 5% DMPG. Las líneas y los círculos rellenos indican el ajuste y los puntos utilizados; los círculos vacíos son puntos no incluidos. Las barras de error representan la desviación estándar de los triplicados.

Muchos AMP, especialmente cuando se usaban vesículas, mostraron un aumento en la fluorescencia en concentraciones bajas de lípidos (con una relación péptido:lípido alta). Este fenómeno ha sido descrito previamente por Melo y Castanho44, donde atribuyen la desviación a la saturación de la bicapa con AMP que impide la absorción de AMP adicionales. También se ha atribuido a cambios en la conformación y a las interacciones péptido-péptido dentro de la bicapa cuando está saturada con AMP45. Para extraer KP donde se observan desviaciones, los puntos desviados se excluyen del ajuste. A concentraciones de lípidos más bajas (alta relación péptido:lípido), se alcanza un punto crítico donde ya no se sigue el modelo hiperbólico y los puntos más allá del punto crítico no pueden describirse mediante la ecuación. (8). Cabe señalar que la eliminación de puntos introduce incertidumbre y aumenta el error de extracción de KP; Esto es particularmente problemático ya que la forma hiperbólica se describe mejor en los puntos iniciales a lo largo de la curva, pero estos también son los puntos más afectados por las altas proporciones péptido:lípido43,44. Tanto para SMA-QA como para LUV, muchos puntos se desviaron de la forma hiperbólica y fue necesario eliminar una gran cantidad de puntos, dejando generalmente los últimos 4 a 5 puntos para el ajuste final.

En resumen, la KP determinada por SPR sigue la tendencia de KD de que 1 > 3 > 2 > 4 > 5 para ambas composiciones de lípidos, con KP determinada en el rango de 0,3–7 × 103 para DMPC y 0,4–13 × 103 para DMPC/PG. . Por otro lado, los KP derivados de MST son inconsistentes tanto con los resultados de SPR como con los KD derivados de MST, incluidas las diferencias esperadas en la partición en DMPC y DMPC/PG (Tabla 4 y Fig. 8). Las dificultades en la extracción de MST KP en comparación con SPR probablemente radiquen en las diferencias intrínsecas en los métodos. MST sin etiquetas se basa en la fluorescencia intrínseca de W y el instrumento mide la intensidad a una longitud de onda fija. La intensidad fluorescente de W está influenciada por la extinción estática y dinámica y puede experimentar cambios de azul, procesos que difieren significativamente entre diferentes entornos, modos de unión y tendencia a autoagregarse46. Los desplazamientos significativos hacia el azul de la emisión W desplazarán el máximo de la señal en diversos grados lejos de la frecuencia de detección estática, lo que dará como resultado una menor intensidad de la señal detectada. Por tanto, además de la distribución de fases, existen factores adicionales que pueden afectar negativamente a la señal detectada.

KP determinados por MST con DMPC (gris claro) y DMPC/PG (gris oscuro) en comparación con SPR. Un KP determinado utilizando nanodiscos MST y SMA. B KP determinado utilizando nanodiscos MST y SMA-QA. C KP determinada utilizando MST y vesículas de 100 nm. D KP determinado usando SPR y vesículas de 100 nm. Las barras de error corresponden al rango de valores para los ajustes por triplicado.

En conjunto, estos resultados mostraron que el método MST explorado no era confiable para extraer KP para nuestro panel de AMP, y que se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados obtenidos. Sin embargo, existen algunas correlaciones que sugieren que con más trabajo, particularmente para aliviar algunos problemas relacionados con el cambio al azul, el MST podría convertirse en una herramienta viable para estimar KP en el futuro. La tecnología de cambio espectral empleada en los dispositivos Nanotemper más nuevos puede ser ideal para explorar más a fondo la extracción de KP mediante MST47.

El KD derivado de SMA-QA y vesículas mostró diferencias entre los dos sistemas lipídicos. Las vesículas producidas tenían un diámetro de ~ 140 nm y, por lo tanto, deberían consistir en aproximadamente 200.000 lípidos (con un peso molecular de ~ 140 MDa). En comparación, los nanodiscos DMPG SMA-QA de 22 nm contienen aproximadamente 1300 lípidos (peso de lípidos de ~ 760 kDa), pero también una fracción sustancial de polímero (Tabla 5). Los AMP utilizados tienen pesos moleculares entre 884 y 1027 Da, por lo tanto, cuando se unen múltiples AMP a un solo disco, el cambio relativo en peso, tamaño y forma del complejo de nanodisco será diferente que con un complejo de vesículas, tal los cambios pueden afectar la medición de Fnorm ya que MST es sensible a estas propiedades de los complejos medidos48. Además, las fracciones de lípidos en los modelos a los que pueden acceder los AMP difieren. En los nanodiscos, ambos lados de la bicapa son accesibles y potencialmente permiten interacciones cooperativas desde lados opuestos de los discos. Por el contrario, para las vesículas solo la valva exterior de la superficie de la vesícula es inicialmente accesible, mientras que la valva interior solo es accesible para los AMP al translocarse primero a través de la bicapa. Sin embargo, como MST es una medición de estado estacionario, no está claro si esto afecta los valores observados.

Otra diferencia entre vesículas y nanodiscos, además del tamaño, es la planaridad de las superficies lipídicas. Solubilizadas como LUV, las vesículas tienen una curvatura superficial ligeramente convexa que introduce tensión superficial49. Los nanodiscos, por otro lado, tienen una superficie plana50, como la superficie de la pared celular que es plana a nivel local. En este contexto, los nanodiscos pueden ser un sistema modelo más representativo. La diferencia en la curvatura de los dos sistemas puede contribuir a la diferencia en las uniones observadas hacia los nanodiscos LUV y SMA-QA. Los péptidos han demostrado propiedades de detección de curvatura, debido a su unión preferencial a defectos de empaquetamiento que surgen debido al estrés de curvatura. La detección de curvatura se ve facilitada por motivos hidrofóbicos en los péptidos y puede mejorar significativamente la unión de los péptidos a membranas más curvadas51,52,53. La importancia de los motivos hidrofóbicos para los péptidos también se caracteriza por la correlación de la agrupación de residuos W con la actividad antimicrobiana4. De hecho, tales efectos se pueden observar en la diferencia de KD medidas de 1 a 4 entre las condiciones lipídicas planas (SPR y SMA-QA) y las especies lipídicas curvas (LUV): los residuos agrupados 1 y 3 tienen una mejora diez veces mayor en la unión. a LUV en comparación con los residuos alternos 2 y 4, que demostraron solo una mejora cuatro veces mayor.

La diferencia de curvatura entre los dos sistemas puede afectar la fase lipídica en las bicapas de los nanodiscos y vesículas. Los lípidos solubilizados en forma de vesículas tienen una fase uniforme (a 25 °C está cerca de la Tm de DMPC y en la fase líquida ordenada)54. Por el contrario, los lípidos en los nanodiscos SMA están menos empaquetados que los solubilizados como vesículas y tienen un punto de fusión reducido55, y se esperan las mismas características de los nanodiscos SMA-QA. Los lípidos centrales de los nanodiscos están en una fase más ordenada50, mientras que los lípidos más externos, más cercanos al cinturón SMA, están perturbados por los grupos estireno de SMA55. Se sabe que los AMP favorecen a los lípidos que se encuentran en una fase más desordenada y, por lo tanto, se esperarían interacciones y distribuciones heterogéneas dentro de los nanodiscos56.

Además de los lípidos, es interesante considerar el papel y el impacto de la carga neta de los respectivos polímeros de la correa con respecto a los dos sistemas de nanodiscos. Se ha demostrado que algunos péptidos desmezclan los lípidos en dominios ricos en lípidos aniónicos57. Cuando se forman tales dominios, se puede explotar el desorden en los límites del dominio58. Se sabe que la carga polimérica afecta la reconstitución de proteínas y especies lipídicas en nanodiscos59,60 y, por lo tanto, se espera que influya en la distribución radial tanto del DMPG aniónico como de los péptidos catiónicos estudiados. La SMA cargada negativamente interactuará favorablemente con los AMP catiónicos a través de interacciones electrostáticas, reteniendo así también el péptido en la proximidad de la región lipídica desordenada. Ravula et al.59 informaron anteriormente sobre el efecto no deseado de las interacciones electrostáticas entre los polímeros de SMA y las especies con carga opuesta, donde se informó que los agregados de proteínas y nanodiscos se deben a fuertes interacciones electrostáticas e hidrofóbicas con el polímero. En MST, esto se observó como una fuerte unión de los AMP tanto a los nanodiscos de SMA como al polímero solo, pero no fue evidente ninguna formación de agregados de nanodiscos. Por el contrario, el SMA-QA catiónico puede tener un efecto repulsivo sobre los AMP, repeliendo potencialmente los AMP de partes de la región más desordenada cerca del polímero, que contiene las interacciones más favorables en el nanodisco (Fig. 9). De manera similar, Ravula et al.59 observaron el efecto beneficioso de las cargas repulsivas sobre la reconstitución de las proteínas de membrana.

Visualización de la diferencia en forma y características de los modelos de lípidos y cómo esto afecta las interacciones de los péptidos antimicrobianos.

La carga de polímero catiónico también podría, por ejemplo, haber contribuido a que SMA-QA-DMPG forme nanodiscos más grandes y heterogéneos en comparación con los nanodiscos SMA-QA-DMPC y SMA (Tabla 5). La carga de polímero también puede haber afectado el contenido final de lípidos de los nanodiscos. La RMN 31P estimó que el contenido de DMPG en los nanodiscos SMA y SMA-QA era del 2,7 y el 4,5% respectivamente, del contenido inicial de vesículas del 5% (Figs. S4-S7), lo que demuestra un efecto negativo en el rendimiento de lípidos y SMA coincidentes. cargos.

La diferencia en el tamaño de las dos preparaciones de nanodiscos también puede influir en las interacciones, ya que los discos más grandes que contienen SMA-QA PG tienen más lípidos en una fase ordenada que los discos SMA más pequeños. Sin embargo, se espera que el papel de la carga neta del cinturón sea el principal factor detrás de la interacción 20-200 veces más fuerte entre los nanodiscos SMA y los AMP catiónicos en comparación con las vesículas y los nanodiscos SMA-QA. Sorprendentemente, mientras que la KD respectiva de los AMP hacia los dos sistemas mostró una unión mucho más mejorada a los nanodiscos aniónicos de SMA, la KP parecía ser medible y consistente con la SPR. Se requieren más estudios para establecer si el KP medido por MST refleja la verdadera partición de los lípidos en los nanodiscos de SMA en este caso, o si la correlación aparente es producto de los efectos de cancelación. En consecuencia, la interacción entre los AMP y el SMA-QA es aproximadamente de 4 a 10 veces más débil que la de las vesículas, probablemente afectada por la diferencia en la curvatura y una repulsión electrostática entre los AMP mutuamente catiónicos y el SMA-QA. Esto podría reducir el área de lípidos accesibles con los que interactuar, en particular los lípidos cercanos al polímero que se encuentran en una fase menos ordenada.

Las diferencias entre SPR y MST KD podrían explicarse por las diferencias experimentales entre los dos métodos. En MST, la respuesta peptídica se controla en función de la concentración de lípidos, mientras que en SPR la masa peptídica añadida a los lípidos inmovilizados en un chip se controla en función de la concentración de péptidos. Al mantener fija la concentración de AMP, no se controla ningún cambio en la actividad debido a procesos dependientes de la concentración, como la autoagregación de AMP, ya sea antes o después de la unión. Por la misma razón, los procesos dependientes de la concentración del sistema lipídico, como la fusión, la agregación o la turbidez, forman parte del perfil de respuesta. A pesar de estas diferencias, la vesícula MST y SPR producen datos de unión que son consistentes entre sí con respecto a la clasificación de los AMP y las diferencias relativas entre los valores de KD determinados.

Hemos demostrado que la MST, aprovechando la fluorescencia intrínseca de W, se puede utilizar para extraer KD, y potencialmente KP, de AMP ricos en W hacia bicapas lipídicas modelo de una manera rápida y sin etiquetas. La KD medida de 1 a 5 se correlaciona bien con sus respectivas actividades bactericidas (representadas por valores de MIC) y con la clasificación de unión obtenida utilizando SPR. Hemos demostrado con éxito que MST se puede utilizar con varias partículas de lípidos (LUV y nanodiscos), lo que demuestra solidez para estudiar las actividades de la membrana. El cinturón de polímero cargado negativamente de nanodiscos SMA no es un andamio de nanodiscos adecuado para estudios de interacción con AMP catiónicos, mientras que los nanodiscos SMA-QA pueden reproducir con precisión los resultados derivados de SPR de los AMP que se unen fuertemente. Por lo tanto, los resultados resaltan la necesidad de una consideración cuidadosa con respecto al sistema lipídico que se utilizará y la interacción que se analizará. Tanto los nanodiscos basados ​​en SMA como en SMA-QA son construcciones adecuadas para ligandos que no interactúan directamente con los polímeros.

La extracción de los parámetros de unión de aglutinantes débiles puede ser un desafío debido a la posible interferencia de los efectos de dispersión de la luz en altas concentraciones de lípidos en comparación con la SPR de última generación. Por otro lado, el análisis MST tiene un tiempo de adquisición mucho más rápido y pequeños requisitos de muestra/lípidos. Con la introducción de hardware automatizado61, MST proporciona una alternativa accesible y de bajo costo con alto rendimiento para estudiar las interacciones ligando-lípido que es complementaria a los ensayos que detectan propiedades disruptivas de la membrana del AMP, como por ejemplo WIND-PVPA, fuga de vesículas o parche- experimentos de pinza62,63,64.

MST también sería un método muy adecuado para realizar experimentos de exploración rentables de las condiciones de las muestras para las interacciones de lípidos, antes de iniciar estudios más avanzados que dependen de una costosa preparación de muestras, etiquetado y/o tiempo de instrumentos.

Los lípidos se adquirieron de Avanti Polar Lipids a través de Sigma Aldrich (Merck KgaA, Darmstadt, Alemania). Consumibles MST de Maricks AS (Oslo, Noruega). Los consumibles SPR se compraron en Cytiva Europe—Norge (Tyristrand, Noruega). Todos los demás materiales se adquirieron de Sigma Aldrich con pureza analítica, a menos que se indique lo contrario. Los péptidos y SMA-QA se prepararon internamente.

Las cepas bacterianas utilizadas fueron E. coli ATCC 25922 y S. aureus ATCC 9144. Los cultivos nocturnos y los ensayos de MIC se realizaron en caldo BD BBL Mueller Hinton II con ajuste catiónico (MHB II, 212322, Becton, Dickson and Company, Sparks, MD, EE.UU).

Se hinchó resina de cloruro de 2-clorotritilo (0,15 mmol, 1,0 meq, 150 mg) en DCM (5 ml) durante 30 min. La resina se drenó y se trató con una solución de aminoácido Fmoc (0,3 mmol) y diisopropiletilamina (1,8 mmol, 313 ml) en DCM (5 ml). La mezcla de resina se dejó durante la noche con agitación suave a temperatura ambiente. La mezcla de resina se drenó, se trató con MeOH (3 x 5 ml) para tapar los sitios que no reaccionaron y se secó con éter dietílico (3 x 5 ml). Los péptidos lineales se prepararon utilizando un sintetizador de péptidos en fase sólida automatizado (Biotage Initiator + Microwave System con Robot Sixty). La resina de cloruro de 2-clorotritilo precargada se hinchó primero en DMF (20 min, 70 °C). Las desprotecciones con Fmoc implicaron el tratamiento de la resina con piperidina al 20 %/DMF (4,5 ml, 3 min) una vez a temperatura ambiente. seguido de un segundo tratamiento a 70 °C mediante reactor de microondas. Los acoplamientos de aminoácidos implicaron el tratamiento de la resina con 4 eq. de Fmoc-aminoácido (0,5 M en DMF), 4 eq. de HOBt (0,5 M en DMF), 4 eq. de HBTU (0,6 M en DMF) y 8 eq. de DIEA (2 M en NMP) durante 5 min a 75 °C mediante un reactor de microondas para todos los aminoácidos Fmoc excepto Fmoc-Arg(Pbf)-OH, que se acopló durante 60 min a temperatura ambiente. Después de cada desprotección de Fmoc y acoplamiento de aminoácidos, la resina se lavó con DMF (4 x 4,5 ml x 45 s). Después de la preparación del péptido lineal protegido con cadena lateral unido a resina, se realizó una desprotección y un lavado final con Fmoc y la resina se secó (3 x 5 ml de MeOH, 3 x 5 ml de Et2O). El péptido unido a resina se trató con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol al 20 % en DCM (2 x 5 ml x 15 min), seguido de un enjuague de la resina con DCM (5 ml ). Los filtrados se combinaron y se concentraron a presión reducida para producir el péptido lineal protegido con cadena lateral.

El péptido lineal (aprox. 0,15 mmol) y diisopropiletilamina (0,9 mmol, 157 ml) se disolvieron en DMF (10 ml) y se añadieron a una solución de PyBOP (0,45 mmol, 234 mg) en DMF (100 ml) con ligera agitación a temperatura ambiente. Después de 1 a 2 h (se controló su finalización mediante espectrometría de masas), la mezcla se concentró a presión reducida y se trató con una solución de TFA/triisopropilsilano/agua (4 ml, 95 %, 2,5 %, 2,5 %) y luego se dejó reposar durante 3h. La mezcla se concentró bajo un flujo de gas N2 seguido de precipitación con éter dietílico enfriado con hielo (15 ml). El precipitado se recogió mediante filtración, se lavó con éter dietílico (15 ml), se disolvió en acetonitrilo al 50 %/agua y se liofilizó para producir el péptido desprotegido de cadena lateral, cíclico, en bruto.

Los péptidos se purificaron mediante HPLC preparativa de fase inversa (instrumento Waters 600 con detector de absorbancia dual Waters 2487) con un SunFire Prep. Columna C18 OBD (10 mm, 19 × 150 mm) que utiliza gradientes lineales de 0,1 % de TFA/agua (tampón A) y 0,1 % de TFA/acetonitrilo (tampón B) con un caudal de 10 ml/min a menos que se indique lo contrario.

Los productos de péptidos cíclicos crudos y finales se analizaron mediante FT-MS (instrumento Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL) y mediante HPLC analítica de fase inversa (sistema Waters 2795 Alliance HT con detector PDA Waters 2996), utilizando una columna Ascentis C18 (3 mm, 3 × 100 mm) y disolventes de 0,1 % de TFA/agua (tampón A) y 0,1 % de TFA/acetonitrilo (tampón B) con un gradiente lineal de 0 a 60 % de tampón B durante 15 min y un caudal de 0,5 ml/min.

Las CMI para 1 a 5 se determinaron utilizando las pautas CLSI M07-A965. Las soluciones de trabajo se prepararon en agua bidestilada que contenía máx. 1% DMSO. Se probó un rango de concentración entre 256 y 0,25 µg/ml para cada péptido. El inóculo bacteriano fue de 1 x 106 células/ml y se incubó 1:1 con cada compuesto de prueba en una placa de fondo redondo de 96 pocillos de polipropileno (655209, Greiner Bio-One, Kresmmuenster, Austria). Cada prueba de MIC se realizó en tres réplicas biológicas, que constan de cuatro réplicas técnicas. Para cada réplica técnica se incluyeron controles positivos (sin antibióticos) y controles negativos (sin bacterias). Se incluyó el antibiótico de referencia eritromicina para asegurar el control de calidad. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C. El valor MIC se definió como la concentración más baja de compuesto que no produce crecimiento bacteriano visible.

Siguiendo el procedimiento de Ravula et al.33, se añadió clorhidrato de cloruro de (2-aminoetil)trimetilamonio (9,38 mmol, 1,3 g) a una solución de anhídrido de ácido estireno maleico (SMA, 1 g) en DMF anhidra (5 ml), seguido de trimetilamina (56,7 mmol, 5 ml) tras lo cual la mezcla adquirió un color amarillo oscuro. La mezcla de reacción se agitó a 70 °C durante 2 h, luego se enfrió hasta temperatura ambiente y se precipitó con éter dietílico. El precipitado se lavó 3 veces con éter dietílico y se secó al vacío. El intermedio seco se disolvió en anhídrido acético (317 mmol, 30 ml), al que se añadieron acetato de sodio (8,05 mmol, 660 mg) y trietilamina (1,98 mmol, 200 mg). La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 12 h, se enfrió y precipitó en éter. El precipitado se lavó 3 veces en éter y se secó al vacío. Luego se disolvió el producto en agua y se pasó a través de una columna Sephadex LH-20. El producto se recogió y luego se liofilizó para dar un polvo marrón cristalino y se confirmó mediante un cambio de frecuencia de estiramiento IR de 1774 a 1693 cm-1 (Fig. S8).

Se prepararon vesículas de DMPC y DMPC:5% de DMPG solubilizando un peso conocido de lípido en cloroformo con una pequeña cantidad de metanol para ayudar en la disolución de los grupos de cabeza lipídica de PG. La solución madre de cloroformo se secó al vacío para producir una película lipídica, que se secó adicionalmente durante 3 h más. La película lipídica se solubilizó en tampón TRIS 10 mM (pH 7,4) que contenía NaCl 100 mM para producir una solución madre lipídica lechosa 20 mM.

Para producir el material de vesículas de trabajo, se extruyó 1 ml de material de vesículas 20 veces a través de un filtro de 0,1 µm utilizando una miniextrusora Avanti Lipids. El tamaño de las vesículas se confirmó utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical Ltd, Malvern, Reino Unido). Una muestra de vesículas de 200 µl medida en microcubetas de 40 µl reveló que los diámetros de las vesículas eran de 144 ± 44 nm (DMPC) y 140 ± 48 nm (DMPC/PG).

Para la preparación de nanodiscos se utilizaron DMPC y DMPC con reservas de vesículas de 21 mM de DMPG al 5%. Las reservas se combinaron con una solución madre de SMA al 8 % para producir una concentración final de SMA del 1 % para nanodiscos de SMA. Las reservas se combinaron con una solución madre de SMA-QA de 100 mg/ml para producir una relación p/p de lípido:SMA-QA final de 1:1,5. La mezcla combinada de SMA/SMA-QA y lípidos se incubó a temperatura ambiente durante la noche y se purificó mediante SEC. Las fracciones que contenían discos SMA/SMA-QA se concentraron usando filtros de centrifugación. La concentración de lípidos totales se determinó mediante RMN 31P (Figs. S4-S7). El tamaño del nanodisco se confirmó utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern Panalytical Ltd, Malvern, Reino Unido). La muestra de nanodisco de 200 µL medida en microcubetas de 40 µL reveló que los diámetros de los nanodiscos eran 10,1 ± 3,0 nm (SMA DMPC), 9,2 ± 2,9 nm (SMA DMPC/PG), 12,8 ± 4,1 nm (SMA-QA DMPC) y 22,5 ± 11,8 nm. (SMA-QA DMPC/PG) (Figs. S9 a S11).

Las mediciones de SPR se realizaron utilizando un instrumento T200 Biacore (GE Healthcare, Oslo, Noruega) a temperatura ambiente. Se cubrió un chip L1 con liposomas de DMPC extruidos (1 mM en tampón HEPES 10 mM, pH 7,4 con NaCl 100 mM) utilizando un caudal de 2 µl/min durante 2400 s. La cobertura del chip se probó mediante inyección de 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina durante 1 min a 30 µL/min, con un cambio de < 400 RU que indica una cobertura suficiente.

Se inyectó una concentración creciente de péptidos probados (péptidos 1, 2, 3 y 4, de 4 a 128 µM; péptido 5, de 24 a 768 µM) sobre vesículas inmovilizadas con un caudal de 15 µL/min durante 200 s con una cámara de 400 s fase de disociación. La superficie del liposoma se estabilizó después de cada inyección mediante tres inyecciones posteriores de NaOH 10 mM a 30 µl/min durante 30 s cada una. Entre experimentos, la superficie del chip se limpió con CHAPS 20 mM, octil-β-d-glucopiranósido 40 mM y etanol al 30% por turno, y cada solución se inyectó durante 1 min a 30 µl/min. La celda de flujo de control se trató de manera idéntica, con la excepción de que solo se inyectó la solución tampón HEPES. Los resultados se procesaron utilizando scripts internos de MATLAB (MATLAB R2020a; los scripts están disponibles en https://github.com/MarJakubec).

KD se obtuvo a partir de un análisis de estado estacionario utilizando las intensidades en el tiempo de disociación de 190 s, utilizando la ecuación. (1):21

donde Req es la respuesta en el equilibrio del estado estacionario, c es la concentración de péptido, Rmax es la respuesta máxima y Roff la respuesta compensada.

KP se obtuvo a partir de los mismos valores de afinidad en estado estacionario utilizando el método presentado por Figuera et al., Eq. (2):21

donde RUS y RUL son las respuestas relativas del soluto (péptidos) y los lípidos respectivamente, γL es el volumen molar de los lípidos, MS y ML son la masa molecular del soluto y del lípido, respectivamente, y [S]W es la concentración de soluto. en agua. KP y σ se obtienen mediante ajuste (siendo σ la proporción de lípidos a solutos).

Para la evaluación de koff hemos utilizado el formalismo de Figuera et al.21 para la linealización del proceso de disociación, donde hemos identificado la contribución de dos poblaciones diferentes en la respuesta de disociación. Luego se obtuvieron los valores de Koff mediante la ecuación. (3) y promediado por la ecuación. (4):

donde SL es la proporción linealizada de soluto y lípido, α y β son poblaciones individuales y SL,r es la fracción de soluto retenido.

Todas las mediciones de MST se realizaron en un NanoTemper Monolith NT. Instrumento sin etiquetas, utilizando Monolith NT. Capilares de fondo cero, tratados estándar y sin etiquetas.

Se preparó una serie de diluciones de vesículas/nanodiscos a partir de concentraciones de lípidos de 3 mM a 100 nM, que comprende 15 muestras discretas y una muestra adicional de lípidos cero, para un total de 16 concentraciones de lípidos. Las muestras finales de MST se prepararon como una combinación de 25 µl de solución lipídica y 25 µl de solución peptídica 5 µM (Tabla S1 en la información de respaldo).

Las mediciones de MST se realizaron con la potencia de excitación establecida en 15%, con la potencia de MST configurada en alta. Los ajustes del tiempo del láser fueron: 3 s pre-láser, 30 s en tiempo y 3 s después del calentamiento. FHot se tomó del período de salto T después de 1,5 s y FCold se tomó en el segundo antes de la activación del láser IR. Para la evaluación de KP se tomó como fluorescencia inicial el valor reportado durante el periodo previo a la aplicación del láser. La respuesta de MST y la fluorescencia inicial se extrajeron directamente como un archivo de texto para su posterior procesamiento en MATLAB.

La constante de disociación KD describe el equilibrio entre la concentración de ligando unido y no unido40.

En un experimento de unión típico que produce una curva sigmoidea, la ecuación de Hill se puede ajustar para producir KD:66

donde y es la respuesta MST, y0 es la respuesta MST del AMP en una solución acuosa (es decir, en ausencia de lípidos), n es el coeficiente de Hill y EMax es el efecto máximo del sustrato probado66. Era necesaria la eliminación de los puntos de respuesta periféricos del MST. Los puntos erróneos se identificaron por formas de trazas de MST deficientes o por una fluorescencia inicial superior a la esperada que estuvo ausente en las otras réplicas o puntos posteriores, pero por lo demás no fue necesario ningún tratamiento adicional de los datos. En todos los casos, la respuesta de MST se representó frente a la concentración logarítmica de lípidos en nM y se ajustó a la ecuación. (6).

El coeficiente de partición Kp define la preferencia de un soluto por un ambiente acuoso o lipídico, donde un Kp mayor indica una mayor preferencia por el ambiente lipídico.

La Kp de una molécula se puede determinar experimentalmente observando cambios en la intensidad fluorescente en presencia de una concentración creciente de lípidos y ajustando la ecuación. (8)43.

En la ecuación. (8) la intensidad de fluorescencia del AMP (I) se normaliza a la intensidad de fluorescencia del AMP en un ambiente acuoso (Iaq), Vm es el volumen molar de los lípidos e IL es la intensidad de fluorescencia del AMP en el ambiente lipídico . Para Vm, se utiliza el volumen molar promedio de la composición lipídica. En el caso de los ambientes solo DMPC se toma como la Vm de DMPC (1.023 nm3), y en la mezcla DMPC-DMPG es el promedio ponderado relativo a la composición utilizada (Vm DMPG = 0.997 nm3)54.

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de datos de investigación abiertos de UiT https://doi.org/10.18710/XZB5KI.

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Este proyecto recibió financiación del proyecto DigiBiotics (Consejo de Investigación de Noruega, ID de proyecto 269425), el proyecto AntiBioSpec de UiT, la Universidad Ártica de Noruega (Cristin ID 20161326) y el proyecto NanoAMP (Consejo de Investigación de Noruega, ID de proyecto 275186).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por UiT La Universidad Ártica de Noruega (incluido el Hospital Universitario del Norte de Noruega).

Departamento de Química, Facultad de Ciencia y Tecnología, UiT, Universidad Ártica de Noruega, 9019, Tromsø, Noruega

Philip Rainsford, Fredrik G. Rylandsholm, Martin Jakubec, Mitchell Silk, John-Sigurd Svendsen, Richard A. Engh y Johan Isaksson

Grupo de Investigación sobre Interacciones de Microbios Hospedadores, Departamento de Biología Médica, Facultad de Ciencias de la Salud, UiT, Universidad Ártica de Noruega, 9019, Tromsø, Noruega

Eric Juskewitz y Johanna U. Ericson

Productos Naturales y Química Medicinal, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias de la Salud, UiT, Universidad Ártica de Noruega, 9037, Tromsø, Noruega

Johan Isaksson

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Conceptualización: PR Síntesis y purificación de péptidos: MS Ensayo MIC: EJ Preparación de nanodiscos y vesículas, y MST: PR y FGR Preparación de vesículas y SPR: MJ Análisis de datos: PR, MJ y JI Borrador original: PR Visualización: PR Redacción y edición: PR , MJ, FGR, MS, JI, RE Supervisión: JI, RE, JSS y JE Todos los autores revisaron y aprobaron la versión final.

Correspondencia a Johan Isaksson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Rainsford, P., Rylandsholm, FG, Jakubec, M. et al. Medición sin etiquetas de las interacciones de péptidos antimicrobianos con vesículas lipídicas y nanodiscos mediante termoforesis a microescala. Informe científico 13, 12619 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39785-0

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Recibido: 02 de mayo de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39785-0

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