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Efecto de las microondas polarizadas linealmente sobre la nanomorfología de la mineralización del carbonato de calcio utilizando péptidos

Jul 07, 2023Jul 07, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12027 (2023) Citar este artículo

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Las microondas se utilizan para diversas aplicaciones, como teléfonos móviles, hornos y dispositivos terapéuticos. Sin embargo, existen pocos informes sobre los efectos de las microondas en enfermedades distintas del cáncer y en procesos fisiológicos. Aquí, nos centramos en la mineralización de CaCO3 como modelo de biomineralización e intentamos dilucidar el efecto de las microondas en la mineralización de CaCO3 utilizando péptidos. Realizamos mediciones de AFM, potencial ζ, HPLC, ICP-AES y permitividad relativa. Nuestros hallazgos muestran que las microondas alteran la nanomorfología del precipitado de CaCO3, desde partículas en forma de esferas hasta estructuras en forma de cuerdas. Además, las microondas tienen poco efecto sobre la mineralización cuando la capacidad de mineralización de un péptido es alta, pero un gran efecto cuando la capacidad de precipitación es baja. Nuestros hallazgos pueden ser aplicables no sólo al tratamiento de dientes y huesos sino también al desarrollo de nanobiomateriales orgánicos-inorgánicos. Esta metodología se puede ampliar a otras reacciones moleculares/atómicas en diversas condiciones de microondas para alterar los parámetros de actividad de la reacción.

Las microondas (MW) se utilizan para diversas aplicaciones, como teléfonos móviles, hornos MW y dispositivos de terapia MW. Sin embargo, los MW generados por estos dispositivos están sujetos a regulaciones internacionales debido a la preocupación por sus efectos en el cuerpo humano. Por ejemplo, hay varios informes que indican que las personas expuestas a microondas durante un período prolongado tienen una alta prevalencia de cáncer1, y aquellos que utilizan mucho teléfonos móviles tienen una alta prevalencia de tumores cerebrales2. Por otro lado, un informe que resume 219 trabajos de investigación epidemiológica sobre los efectos de los tumores cerebrales en jóvenes no mostró un aumento de la morbilidad debido a la exposición a los microondas resultante del uso de teléfonos móviles3. Los MW tienen una alta biopermeabilidad y capacidad de calentamiento y, por lo tanto, se utilizan para productos de calentamiento ortopédico y para el tratamiento del cáncer de hígado4. Los MW también se utilizan en la síntesis de materiales orgánicos5,6,7,8, materiales inorgánicos9,10,11,12 y péptidos13,14. Sin embargo, en el campo de las ciencias biológicas, existen pocos informes de investigación sobre los efectos de las MW en enfermedades distintas del cáncer o en la fisiología. Las enfermedades y la fisiología afectan las respuestas de las células debido a interacciones complejas de biomoléculas como proteínas y péptidos. Por lo tanto, el comportamiento de varias moléculas bajo irradiación MW requiere un análisis detallado para dilucidar los efectos de los MW sobre las enfermedades y las funciones biológicas. En este estudio, nos centramos en la mineralización del carbonato de calcio (CaCO3) como modelo de reacción biológica15,16,17,18,19,20,21,22,23, el proceso mediante el cual se forman los exoesqueletos de crustáceos, dientes y huesos. . La biomineralización es la precipitación de inorgánicos por biomoléculas como proteínas y péptidos24. Anteriormente nos centramos en la precipitación de CaCO3 utilizando péptidos e intentamos dilucidar aspectos del mecanismo subyacente a la biomineralización modificando el extremo N en la secuencia central de los péptidos precipitantes de carbonato de calcio (CaCO3) (secuencia CAP-1, una parte del exoesqueleto del cangrejo de río)15 . Investigar el efecto de los MW sobre la biomineralización de CaCO3 utilizando péptidos ayudaría a dilucidar el comportamiento de moléculas tanto orgánicas como inorgánicas, proporcionando pistas sobre el efecto de los MW en los procesos biológicos. Preparamos un transmisor semiconductor (Minato Medical Science Co., Ltd.) para generar MW polarizados linealmente (direccionales) y analizamos la correlación entre los vatios de salida del MW y la morfología, el potencial ζ, la precipitación, el consumo de péptidos, etc., en la mineralización utilizando péptidos. . Estos experimentos proporcionarán una comprensión más detallada de la relación entre los parámetros de MW y los parámetros de biomineralización, que serán aplicables no sólo al tratamiento de dientes y huesos sino también al desarrollo de nanomateriales inorgánicos. Además, este estudio proporciona información sobre los efectos de los MW en otras moléculas, y estos efectos podrían controlarse cambiando los parámetros de los MW, como la polarización de la irradiación y los vatios de salida.

Primero, seleccionamos los péptidos para este estudio. Anteriormente analizamos en detalle los efectos de la mineralización de CaCO3 utilizando cuatro péptidos con diferentes cargas negativas netas modificando el extremo N en la secuencia central de los péptidos precipitantes de CaCO3 (secuencia CAP-1, una parte del exoesqueleto del cangrejo de río)15,23 (Fig. .1). Brevemente, modificamos las secuencias centrales mediante fosforilación del extremo N y/o acetilación del extremo N o dejamos el extremo N sin modificar. Estimamos el cambio en la capacidad de precipitación de CaCO3 de cada péptido mediante espectroscopia de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AES). Estos péptidos mostraron diferentes capacidades para la precipitación de CaCO3 (Fig. S1). El orden de mayor capacidad de precipitación fue péptido Ac-S ≈ > péptido Ac-pS > péptido pS > péptido S.

Secuencias y estructuras peptídicas. Secuencias de los péptidos precipitantes de CaCO3, (a) péptido S, (b) péptido Ac-S, (c) péptido pS y (d) péptido Ac-pS, utilizados en este estudio.

Se utilizó un transmisor de tipo semiconductor como fuente de MW y se colocó una antena polarizada linealmente para irradiar MW desde debajo de la muestra (Fig. 2a). Los dispositivos MW generales, como los hornos MW y los dispositivos médicos de terapia MW, generan MW utilizando un magnetrón. Los MW oscilados por el magnetrón tienen una amplia banda de frecuencia. Además, la frecuencia central de oscilación puede fluctuar cuando la salida está controlada de forma analógica. Aquí, fabricamos un generador semiconductor de MW que consta de un oscilador digital controlado por frecuencia y un amplificador semiconductor para minimizar los efectos de factores de fluctuación como la frecuencia. Además, la energía de salida es controlada por un controlador de servicio aprovechando las características del semiconductor. Por lo tanto, este dispositivo de irradiación de MW emite una banda más estrecha y sin fluctuaciones de frecuencia que la de los dispositivos de magnetrón.

Equipos de irradiación MW. ( a ) Equipo de irradiación MW utilizado en este estudio. (b) Variación de la temperatura de la solución al cambiar los vatios de salida del equipo de irradiación MW.

Luego analizamos la intensidad del campo E del equipo de irradiación de MW y verificamos la dirección de polarización en la muestra irradiada de MW. Sin embargo, la distribución de la intensidad del campo E generada por este pequeño dispositivo de irradiación de MW no es uniforme en un amplio rango. En consecuencia, el dispositivo de medición del campo E requiere una resolución espacial de la intensidad, frecuencia y dirección de polarización del campo E en y alrededor del microtubo que contiene la solución de la muestra de prueba, y la resolución espacial debe ser menor o igual al tamaño del el microtubo. Por lo tanto, como dispositivo de medición de campo E, utilizamos un sensor óptico de campo E con una guía de ondas óptica formada sobre un pequeño elemento de Pockels y una pequeña antena dipolo formada por películas delgadas metálicas triangulares opuestas con una base de 1,5 mm × una altura de 1,2. mm. Las características ópticas del elemento se ven alteradas por el campo E recibido por la antena (efecto electroóptico). El campo E generado al pasar un rayo láser a través de la guía de ondas óptica modula ópticamente directamente el rayo láser, que luego pasa a través de la fibra óptica. Esto permite medir la intensidad del campo E, la frecuencia y la dirección de polarización sin ser perturbado por los MW que irradian la señal de medición. La dirección de polarización era vertical a un eje mayor de la antena del sistema de irradiación MW. Además, este dispositivo de irradiación MW genera una banda significativamente estrecha sin fluctuaciones de frecuencia (Fig. S2a). Estos resultados sugirieron que este equipo de irradiación de MW puede generar una intensidad de campo E con una frecuencia exacta de 2,45 GHz y polarización lineal, lo que permite un análisis detallado de la relación entre los MW y el comportamiento de las biomoléculas involucradas en la biomineralización.

A continuación, medimos la temperatura de la solución de muestra bajo irradiación MW usando un termómetro termopar porque los MW calientan localmente la muestra. La temperatura promedio y la temperatura máxima aumentaron gradualmente con la producción de vatios del equipo de irradiación MW (Figs. 2b, S2b). La temperatura promedio en la solución de muestra después de la irradiación MW a un vatio de salida máximo (60 W) fue de 37,2 °C y la temperatura máxima fue de 41,1 °C.

Los precipitados de CaCO3 formados en condiciones de irradiación MW y sin irradiación a una concentración de péptido de 100 µM se observaron mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las imágenes AFM mostraron que el CaCO3 mineralizado usando el péptido S forma principalmente precipitados en forma de esferas en ausencia de irradiación (MW sin irradiación) a 37 °C (Figs. 3a, S3e) y precipitados en forma de cuerdas bajo irradiación MW (Figs. 3b, S3a). También comprobamos que el CaCO3 apenas parece precipitar sin péptidos (Fig. S3i). Las imágenes TEM mostraron la formación de precipitados en forma de cuerdas bajo irradiación de microondas (Fig. S3j) y la formación de precipitados de partículas en condiciones de no irradiación de microondas a 37 °C, 60 °C y 90 °C (Fig. S3k-m). , que casi correspondía a las imágenes del AFM. Estos resultados sugieren que la precipitación de CaCO3 ocurre bajo irradiación MW mediante un mecanismo de precipitación diferente al de condiciones de no irradiación MW. Los experimentos se realizaron con secuencias peptídicas que se sabe que tienen una mayor capacidad de precipitación que el péptido S (Fig. S1). Por el contrario, los resultados apenas mostraron la formación de precipitados de CaCO3 en forma de cuerda bajo irradiación MW con péptido pS, péptido Ac-S y péptido Ac-pS (Fig. S3b-d), o en condiciones de MW sin irradiación a 37 °C. (Figura S3f-h). Por lo tanto, disminuimos gradualmente la concentración de cada péptido y observamos la morfología de los precipitados de CaCO3 bajo irradiación MW. A una concentración de péptido de 10 µM, tanto el péptido S como el péptido pS dieron como resultado precipitados en forma de cuerda en condiciones de irradiación con microondas (Fig. S4a, b), mientras que los precipitados con forma de esfera se observaron predominantemente usando los otros péptidos bajo irradiación con microondas (Fig. S4c). d). Todas las condiciones peptídicas apenas proporcionaron precipitados en forma de cuerdas bajo MW sin irradiación (Fig. S4e-h). El péptido S a 1 µM no causó precipitación de CaCO3 debido a su baja capacidad de precipitación, pero se pudieron observar precipitados en forma de cuerdas con todos los demás péptidos en condiciones de irradiación MW (Fig. S5a-d). Los precipitados de partículas se observaron principalmente a temperatura ambiente o con calentamiento sin irradiación MW (Fig. S5e-h). Estos resultados sugieren que se pueden formar precipitados en forma de hilos incluso a 100 µM para péptidos con baja capacidad de precipitación, mientras que pueden formarse precipitados en forma de hilos solo a 1 µM para péptidos con alta capacidad de precipitación (Tabla 1).

Cambio de morfología con irradiación MW. (a) Imagen AFM de precipitados de CaCO3 utilizando péptido S 100 μM a 37 ° C bajo irradiación sin MW (representante de la imagen de partículas). (b) Imagen AFM de precipitados de CaCO3 utilizando péptido S 100 μM bajo irradiación MW a 60 W (representante de la imagen de cadena). (c) Potenciales ζ de las muestras después de la mineralización de CaCO3 utilizando péptidos 10 μM en condiciones de irradiación MW y sin irradiación.

A continuación, se determinó el potencial de superficie de CaCO3 formado en condiciones de irradiación MW y sin irradiación utilizando péptido 10 µM mediante mediciones de potencial ζ. Los valores potenciales de ζ fueron negativos para todos los péptidos en condiciones de MW sin irradiación (Fig. 3c). Por el contrario, en condiciones de irradiación MW, los valores de potencial ζ fueron positivos en condiciones que dieron como resultado precipitados en forma de cuerdas (péptido S y péptido pS), y los valores de potencial ζ fueron negativos en condiciones que dieron como resultado precipitados en forma de esfera (péptido Ac-S). y péptido Ac-pS) (Fig. 3c). Estos resultados sugirieron que los péptidos estaban unidos a la superficie de los precipitados en forma de esfera y el calcio estaba unido a la superficie de los precipitados en forma de cuerdas, ya que estos péptidos estaban cargados negativamente y los iones de calcio (Ca2+) estaban cargados positivamente.

Luego disminuimos gradualmente los vatios de salida (60, 20, 10 y 0 W) utilizados para la irradiación MW y confirmamos las morfologías y los potenciales ζ de los precipitados de CaCO3 utilizando péptido pS 10 µM. La imagen AFM a 60 W mostró solo precipitados en forma de cuerdas (Fig. 4a, S4b, S6g), mientras que la de 20 W mostró una mezcla de precipitados en forma de cuerdas y partículas esféricas (Fig. 4b, S6h). Las imágenes de AFM tanto a 0 como a 10 W mostraron partículas esféricas (Figs. 4c, d, S3f, S6i, j). Los valores del potencial ζ disminuyeron gradualmente de positivos a negativos a medida que disminuyeron los vatios de salida, y las muestras con más precipitados similares a partículas mostraron potenciales ζ más negativos. Esto fue consistente con los resultados anteriores derivados de los péptidos 10 µM (Figs. 3c, S4).

Cambio de morfología con los vatios de salida. (a) Péptido pS 10 µM (60 W). (b) péptido pS 10 µM (20 W). (c) péptido pS 10 µM (10 W). (d) Péptido pS 10 µM (0 W). (e) Potencial ζ de las muestras después de la mineralización de CaCO3 bajo varios vatios de salida.

En el caso de péptidos cuyas capacidades de precipitación eran relativamente altas, se seleccionó 1 µM como concentración de péptido para el análisis de potencial ζ (disminuyendo los vatios de salida (60, 20, 10 y 0 W) utilizados para la irradiación MW). Los valores potenciales de ζ disminuyeron gradualmente de positivos a negativos a medida que disminuyeron los vatios de salida (Fig. S6a, b), de manera similar al análisis del péptido pS 10 µM (Fig. 4e). En el caso de péptidos cuyas capacidades de precipitación eran relativamente bajas, se seleccionó 100 µM como concentración de péptido para el análisis del potencial ζ (disminuyendo los vatios de salida (60, 20, 10 y 0 W) utilizados para la irradiación MW). Los valores de potencial ζ disminuyeron gradualmente de positivos a negativos a medida que los vatios de salida disminuyeron de manera similar al otro análisis de péptidos (Fig. S6c). Cuando se redujo la potencia de MW, también confirmamos que la morfología cambió de cuerda a partícula para el péptido Ac-S 1 µM, el péptido Ac-pS 1 µM y el péptido S 100 µM mediante AFM (Fig. S6d-f). Estos resultados implicaron que los péptidos con menor capacidad de mineralización y/o una menor concentración de péptido influyeron en el resultado de la irradiación de MW (morfología similar a una cuerda y potencial ζ positivo), y que una producción de MW más fuerte influyó en la mineralización.

Intentamos estimar las tasas de consumo de los péptidos (la tasa de cantidad de cada péptido unido o atrapado en los depósitos de CaCO3 a la cantidad inicial de péptido) utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para determinar la cantidad de péptido residual después de precipitación (Fig. 5a). Las tasas de consumo de todos los péptidos se mantuvieron sin cambios en condiciones de irradiación MW y de no irradiación MW a 37 °C, mientras que las tasas de consumo de todos los péptidos en condiciones de no irradiación MW a 60 °C aumentaron en relación con aquellas en condiciones de no irradiación MW. condiciones a 37°C. Estos resultados sugieren que los MW tienen un efecto menor sobre los péptidos.

Efectos del PM sobre el Ca2+ y los péptidos bajo mineralización. (a) Consumo de péptido determinado a partir de las áreas de los picos después de los análisis de HPLC. (b) La cantidad de Ca2+ utilizada para la precipitación en varias muestras de péptidos según lo determinado por ICP-AES.

Posteriormente, estimamos el cambio en la capacidad de precipitación de CaCO3 de cada péptido en condiciones de microondas utilizando ICP-AES. Primero confirmamos que la cantidad de Ca2+ utilizada para la precipitación (cantidad de precipitados en la muestra convertida en mol de Ca2+) determinada por ICP-AES se correlacionaba aproximadamente con nuestro análisis previo mediante titulación estándar con etilendiaminotetraacetato23 en condiciones de irradiación sin MW (Fig. 5b, barras grises). La irradiación MW aumentó la cantidad de Ca2+ utilizada para la precipitación en condiciones (péptido S y péptido pS), lo que resultó en la formación de precipitados en forma de cuerdas (Fig. 5b, barras rojas). Por el contrario, la cantidad de Ca2+ utilizada para la precipitación no cambió bajo las condiciones (péptido Ac-S y péptido Ac-pS), lo que resultó en la formación de precipitados en forma de esfera (Fig. 5b, barras rojas). Además, medimos la permitividad relativa de la solución de Ca (HCO3) 2 y cada péptido para determinar su susceptibilidad a la irradiación MW. Todos los péptidos mostraron valores de permitividad relativa igualmente más bajos, mientras que la permitividad relativa de la solución de Ca (HCO3) 2 fue al menos 4 veces mayor que la de los péptidos (Fig. S7).

Todos los resultados de HPLC, ICP-AES y mediciones de permitividad relativa implicaban que los cambios morfológicos podrían atribuirse al efecto de los MW principalmente al Ca2+ y que las diferencias en los efectos de los MW sobre los péptidos eran relativamente bajas. Por otro lado, CaCO3 no precipitó sin péptidos. Por lo tanto, los péptidos con menor capacidad de mineralización y/o una menor concentración de péptido influyeron en los resultados morfológicos de la irradiación MW, que correspondieron al análisis de potencial ζ descrito anteriormente.

En conclusión, efectos significativos del PM alteran la morfología de los precipitados de CaCO3, desde partículas en forma de esferas hasta estructuras en forma de cuerdas. Además, los MW tienen poco efecto sobre la mineralización de CaCO3 cuando la capacidad de precipitación de CaCO3 de un péptido es alta, mientras que los MW tienen un gran efecto cuando la capacidad de precipitación del péptido es baja. Este estudio arroja luz sobre la relación entre varios parámetros de MW, como los vatios de salida, y varios parámetros de péptidos de mineralización, como la cantidad de precipitación. En estudios futuros, utilizaremos la química computacional para investigar la relación directa entre los PM, las secuencias de péptidos y la mineralización25,26 y los compararemos con los resultados experimentales húmedos. Nuestros hallazgos pueden ayudar en el tratamiento de dientes y huesos y en el desarrollo de nanobiomateriales orgánicos-inorgánicos. Además, los hallazgos descritos en este documento no se limitan a la nanomineralización, sino que pueden ampliarse a otras reacciones moleculares/atómicas en diversas condiciones de MW, como los vatios de salida, para alterar los parámetros de actividad de la reacción.

Todos los productos químicos y disolventes eran de grado reactivo o HPLC y se utilizaron sin purificación adicional. La HPLC se realizó en un sistema de HPLC GL-7400 (GL Sciences, Tokio, Japón) utilizando una columna Inertsil ODS-3 (10 × 250 mm; GL Sciences) para la purificación preparativa, con acetonitrilo lineal/ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. gradiente a un caudal de 3,0 ml/min. Los péptidos se analizaron utilizando MALDI-TOF MS en un espectrómetro de masas Autoflex III (Bruker Daltonics, Billerica, MA, EE. UU.) con ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxicinámico como matriz. El análisis de aminoácidos se realizó utilizando una columna Inertsil ODS-2 (4,6 × 200 mm; GL Sciences) después de que las muestras se hidrolizaron en HCl 6 M a 110 °C durante 24 h en un tubo sellado y luego se marcaron con fenilisotiocianato.

Los péptidos se sintetizaron manualmente en resina Wang utilizando el método DIPCI (N,N'-diisopropilcarbodiimida)-DMAP (N,N-dimetil-4-aminopiridina) para el primer residuo, y la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc27 con 2-(1H -hexafluorofosfato de -benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU, Watanabe Chemical, Hiroshima, Japón)-1-hidroxibenzotriazol (HOBt, Watanabe Chemical) para los residuos posteriores. La desprotección de Fmoc se realizó utilizando HOBt al 1 % y piperidina al 25 % en NMP (N-metilpirrolidona). La protección de la cadena lateral fue Ot-butilo (OtBu) para Asp, Glu y Ser, y O-bencilo (OBzl) para fosfoserina (pSer). ). Los péptidos se escindieron de las resinas y se eliminó la protección de la cadena lateral incubando el péptido-resina durante 2 h en TFA (Watanabe Chemical Industries)/H2O/triisopropilsilano (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) (20:1:1, v/v). Los péptidos se precipitaron mediante la adición de éter dietílico frío y se recogieron mediante centrifugación. Los péptidos se purificaron mediante RP-HPLC y se caracterizaron mediante análisis de aminoácidos y EM MALDI-TOF: péptido S, m/z 1012,8 ([M + H]+ calcd. 1012,8); péptido pS, m/z 1092,8 ([M + H]+ calculado 1093,3); Péptido Ac-S, m/z 1052,4 ([M - H]- calculado 1052,8); Péptido Ac-pS, m/z 1132,3 ([M − H]− calcd. 1132,8). Los péptidos se disolvieron en agua MilliQ hasta aproximadamente 1 mM y la concentración se determinó mediante análisis de aminoácidos. Las soluciones de péptidos se almacenaron a 4 °C.

En la Fig. 2a se muestran esquemas y una fotografía del dispositivo de microondas utilizado en este estudio. Minato Medical Science Co., Ltd., Osaka, Japón, fabricó un sistema generador de microondas (MW) de tipo semiconductor personalizado. La potencia de salida mínima-máxima utilizada en este estudio fue de 10 a 60 W (en pasos de 10 W); la energía se enviaba a un sistema tipo transformador de CA; la frecuencia de oscilación fue de 2450 ± 5 MHz [un valor de compensación, el valor medido fue de 2450 ± 3 MHz (Fig. 2a)]; la antena era una antena de parche (onda polarizada linealmente) VSWR < 1,4; 9–45 % (10–50 W) para la relación de trabajo. Tenga en cuenta que el generador de semiconductores se conectó mediante un convertidor de guía de ondas coaxial y la pérdida de potencia de MW que se produjo se corrigió de antemano. La irradiación MW se realizó de la siguiente manera: (1) irradiación MW durante 80 min; (2) Quitar la cubierta protectora de agua y dejarla a temperatura ambiente durante 20 minutos; (3) Irradiación MW durante 80 min.

Los campos E de los MW irradiados de los generadores se monitorearon utilizando un cabezal sensor (6 × 6 × 23 mm, ES-100, Seikoh Giken Co., Ltd., Matsudo, Japón) y un controlador (C5-D1-A , Seikoh Giken Co., Ltd.). La intensidad del campo E [dBμV/m] se obtuvo mediante el siguiente cálculo:

Se insertó un termómetro de termopar (Card Logger MR5300, MR9302, CHINO Corp., Tokio, Japón) en un microtubo que contenía 1 ml de agua MilliQ y se midió el cambio de temperatura debido a la irradiación de MW a 10–60 W. Anteriormente, habíamos verificado que la temperatura había sido casi la misma que la medición del termopar mediante la medición del punto de tiempo usando termografía (OPTXI40LTF20CFT090, Optris GmbH, Berlín, Alemania).

Antes de la precipitación de CaCO3, se suspendió CaCO3 (0,5 mmol) en agua MilliQ (30 ml). Se burbujeó gas CO2 en la suspensión agitada durante 1 h, luego el CaCO3 sólido restante se eliminó mediante filtración. La concentración de Ca2+ en la solución se determinó mediante titulación estándar con etilendiaminotetraacetato22,23. La precipitación con CaCO3 se realizó en un microtubo. La solución de Ca (HCO3) 2 y la solución de péptidos se diluyeron y se mezclaron hasta la concentración deseada con agua MilliQ y se incubaron durante 3 h. La irradiación MW se realizó de la siguiente manera: (1) irradiación MW durante 80 min; (2) Retire la cubierta protectora de agua y déjela a temperatura ambiente durante 20 minutos; (3) Irradiación MW durante 80 min. En condiciones de no irradiación de MW, se utilizó el sistema de control de temperatura del programa (PC708, ASTEC, Fukuoka, Japón) para calentar a 37 °C, 60 °C y 90 °C.

Todo el volumen de cada muestra se colocó sobre mica recién cortada (1 x 1 cm). Después de 5 min, el disolvente se absorbió con papel de filtro. Luego se colocó agua MilliQ (20 µL) sobre la superficie de mica y se absorbió inmediatamente con papel de filtro. Este proceso se repitió tres veces para eliminar las sales de la muestra. Todas las muestras se secaron al vacío antes de las mediciones de AFM. Las imágenes en modo de golpeteo se obtuvieron en un microscopio de sonda de barrido multimodo con un controlador Nanoscope IIIa (Veeco, Woodbury, NY, EE. UU.).

La muestra de precipitación de CaCO3 (20 µL) se colocó en una rejilla TEM durante 1 min y se secó con papel de filtro. Luego se colocó agua MilliQ (20 µL) en la rejilla y se absorbió inmediatamente con papel de filtro. Este proceso se repitió tres veces. Todas las muestras se secaron al vacío antes de las mediciones TEM, que se realizaron a un voltaje de aceleración de 115 kV (JEM-1400, JEOL, Tokio, Japón).

La solución de muestra (750 ml para el potencial ζ) se transfirió a una celda capilar plegada (DTS1070, Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) para mediciones del potencial ζ. Los datos del potencial ζ se adquirieron en un instrumento Zetasizer ZEN3600 (Sysmex, Kobe, Japón) equipado con un láser de 633 nm.

Después de la precipitación con CaCO3 (péptido 10 µM, Ca(HCO3)2 150 µM), se agregaron 300 µl de agua MilliQ (que contenía TFA al 0,1%) a una muestra de 1,2 ml. La muestra de 400 µl se filtró con un filtro centrífugo (Durapore®-PVDF 0,22 µm Ultrafree®-MC-GV, Merck, Tokio, Japón), luego se realizó el análisis RP-HPLC inyectando una muestra de 1 ml en un Inertsil ODS-3. columna (4,6 × 150 mm; GL Science) y eluyendo con un gradiente lineal de acetonitrilo/TFA al 0,1 % a un caudal de 1,0 ml/min.

Después de la precipitación con CaCO3 (péptido 10 µM, Ca(HCO3)2 150 µM), se filtraron muestras de 2 ml con un filtro centrífugo (Durapore®-PVDF 0,22 µm Ultrafree®-MC-GV). Después de la mineralización de CaCO3, las muestras se pirolizaron con 5 ml de CH3COOH 1 mM y 5 ml de HClO4 durante 1 h a 120 °C28. Después de la pirólisis, las muestras se disolvieron con 1 ml de HCl 6 mM y 9 ml de agua MilliQ. Las curvas de calibración para cada elemento se obtuvieron utilizando una solución estándar de Ca (para análisis espectroquímico de absorción atómica, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries) en el rango de 0 ppm a 10 ppm. Se detectó Ca a una longitud de onda de 389,785 nm utilizando un ICP-AES (Spectroblue® FMX36, Hitachi High-Tech Corporation Tokyo, Japón) proporcionado por Clean Chemical Co. Ltd.

Se transfirieron una solución de péptido 10 µM (1 ml) y una solución de Ca(HCO3)2 150 µM (1 ml) al instrumento de permitividad relativa (SH2-Z, TOYO Corporation, Tokio, Japón) proporcionado por el Instituto de Tecnología de la Prefectura de Hyogo. Se adquirieron datos de permitividad relativa a 0,2 MHz.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Los autores agradecen al Prof. K. Akamatsu, Dr. T. Tsuruoka, Sra. M. Oura, Sra. M. Hirata, Sr. K. Iwata (Universidad de Konan, Kobe, Japón), Sr. Y. Harada (Clean Chemical Co. . Ltd., Suita, Japón), Dr. T. Imai, Sr. S. Fujimoto (Universidad Ryukoku, Otsu, Japón), Sr. H. Izumi (Instituto Tecnológico de la Prefectura de Hyogo, Kobe, Japón), Sr. K. Minaki, el Sr. H. Togashi (DSP Research, Inc., Kobe, Japón) y el Sr. T. Uraka (Minato Medical Science Co. Ltd., Osaka, Japón) por sus valiosas discusiones y su generoso apoyo. Este estudio fue financiado en parte por el Instituto de Investigación de la Universidad de Konan.

Los siguientes autores contribuyeron en partes iguales: Kenji Usui, Makoto Ozaki y Kan Hirao.

Facultad de Fronteras de la Investigación Innovadora en Ciencia y Tecnología (FIRST), Universidad de Konan, Kobe, Japón

Kenji Usui, Makoto Ozaki, Kan Hirao, Tsubasa Kosaka, Natsumi Endo, Shuhei Yoshida, Shin-ichiro Yokota y Fumihiro Kayamori

Instituto de Investigación sobre Nanobioambiente y Radiaciones No Ionizantes (RINNIR), Universidad de Konan, Kobe, Japón

Kenji Usui, Nobuhiro Nakanishi, Tomohiro Umetani y Fumihiro Kayamori

Beyond5G, conferencias donadas, Universidad de Konan, Kobe, Japón

Kenji Usui y Nobuhiro Nakanishi

Minato Medical Science Co. Ltd., Osaka, Japón

Yonejiro Arimoto

Seikoh Giken Co. Ltd., Matsudo, Japón

ryuji osawa

DSP Research, Inc., Kobe, Japón

Nobuhiro Nakanishi

Departamento de Química de Materiales, Universidad Ryukoku, Otsu, Japón

Kinya Tomizaki

Centro de Investigación de Procesamiento y Materiales Innovadores, Universidad Ryukoku, Otsu, Japón

Kinya Tomizaki

Facultad de Inteligencia e Informática, Universidad de Konan, Kobe, Japón

Tomohiro Umetani

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TU y KU concibieron la idea original y YA, RO, NN y FK prepararon y evaluaron el sistema de irradiación MW. MO, KH, TK, NE, SY, Si.Y. y KU sintetizó los péptidos y realizó experimentos y mediciones de mineralización. MO y KU escribieron el artículo completo. MO, KH, FK, K.-yT, TU y KU escribieron los detalles experimentales, los resultados y la discusión. Todos los autores revisaron el artículo. KU, KH y FK revisaron el manuscrito y abordaron los comentarios de los revisores.

Correspondencia a Kenji Usui o Fumihiro Kayamori.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Usui, K., Ozaki, M., Hirao, K. et al. Efecto de las microondas polarizadas linealmente sobre la nanomorfología de la mineralización del carbonato de calcio mediante péptidos. Informe científico 13, 12027 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-37473-7

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Recibido: 10 de marzo de 2023

Aceptado: 22 de junio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-37473-7

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