Sinergia entre los péptidos antimicrobianos de la platija de invierno

Jul 03, 2023

npj Antimicrobianos y resistencia volumen 1, número de artículo: 8 (2023) Citar este artículo

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Algunos péptidos antimicrobianos (AMP) tienen una potente actividad bactericida y se están considerando como posibles alternativas a los antibióticos clásicos. En respuesta a una infección, estos AMP a menudo se producen en animales junto con otros péptidos con actividad antimicrobiana baja o nula perceptible, cuyo papel no está claro. Aquí mostramos que seis AMP de Winter Flounder (WF) actúan en sinergia contra una variedad de patógenos bacterianos y brindan información mecanicista sobre cómo esto aumenta la cooperatividad de la actividad y potencia bactericida dependiente de la dosis que permiten la terapia. Sólo dos WF AMP tienen una potente actividad antimicrobiana cuando se usan solos, pero encontramos una serie de combinaciones bidireccionales, que involucran péptidos que de otro modo tienen poca o ninguna actividad, producen una potente actividad antimicrobiana. Los WF AMP débilmente activos modulan las interacciones de membrana de los WF AMP más potentes y permiten la terapia en un modelo de infección de heridas por quemaduras por Acinetobacter baumannii. La sinergia observada y el comportamiento emergente pueden explicar los beneficios evolutivos de producir una familia de péptidos relacionados y son propiedades atractivas a considerar al desarrollar AMP para aplicaciones clínicas.

En marcado contraste con la aparición y propagación de la resistencia a los antibióticos posteriores a la década de 1930, los péptidos antimicrobianos (AMP) han seguido siendo un componente eficaz del sistema inmunológico innato a lo largo de la historia evolutiva. Las diferencias clave entre la mayoría de los antibióticos de uso clínico y los AMP son que estos últimos son rápidamente bactericidas y su actividad bactericida dosis dependiente es altamente cooperativa1,2. Esta propiedad farmacodinámica (PD) deseable debería garantizar que exista una "ventana de selección de mutantes" más pequeña, minimizando la presión selectiva asociada con un intento de respuesta terapéutica. Cuando la resistencia a los AMP se desarrolla experimentalmente en bacterias, comúnmente utilizando condiciones de concentración inhibidora submínima (CIM), se puede lograr una sensibilidad reducida y también existe el riesgo de resistencia cruzada entre los AMP exógenos y los péptidos de defensa humanos3. Sin embargo, dicha adaptación es relativamente modesta y puede verse limitada por limitaciones evolutivas4,5. Por lo tanto, si sus propiedades mejoradas de PD realmente mitigan el riesgo de que surja resistencia a los AMP, su rápida producción y/o entrega en concentraciones supra-MIC garantizaría que su utilidad perdure.

De manera análoga al uso de terapias combinadas en la clínica para reducir las tasas de resistencia6, se ha descubierto que las combinaciones de AMP diferentes tienen propiedades de EP mejoradas in vitro2. Sin embargo, los AMP seleccionados procedían de diferentes organismos y, a pesar de nuestro propio trabajo con temporin L y temporin B de Rana temporaria, aún no está claro hasta qué punto los AMP del mismo organismo pueden combinarse para mejorar tanto la potencia antibacteriana como la cooperatividad de la actividad bactericida7.

La platija de invierno (WF), Pleuronectes americanus, produce la pleurocidina AMP8, cuya actividad antimicrobiana potente y de amplio espectro puede atribuirse a su capacidad dual de dañar la membrana plasmática bacteriana9,10, pero también de cruzarla para acceder a objetivos intracelulares11,12. ,13. El equilibrio de la contribución de los dos efectos a la acción bactericida puede variar según la especie bacteriana y puede verse afectado por el entorno nutricional y, por tanto, el metabolismo bacteriano14. Los análogos de la pleurocidina que tienen una mayor actividad disruptiva de la membrana pueden ser más robustos y suficientemente potentes para ser terapias efectivas incluso cuando se administran sistémicamente en modelos exigentes de infección pulmonar bacteriana14. Desde que una revisión de la cartera de proyectos, encargada por Wellcome Trust15, “recomienda un fuerte apoyo para la financiación mientras se monitorean los avances en materia de terapia sistémica” para un nivel de enfoques que incluyen AMP, está claro el potencial de que la pleurocidina y sus análogos se sigan desarrollando.

Después de la identificación de la pleurocidina, se descubrieron más WF AMP16,17. Las pruebas de susceptibilidad antibacteriana de la pleurocidina (denominada WF2) y cinco WF AMP adicionales (secuencias proporcionadas en la Tabla 1) revelaron que WF1a-1 compartía la potencia de amplio espectro de WF2, mientras que WF4 tenía actividad solo contra bacterias Gram-negativas17. Las actividades antibacterianas de WF1, WF1a y WF3 fueron modestas o ausentes17. Aún no se sabe si existen sinergias, en términos de potencia o cualquier otro parámetro, entre los WF AMP activos o aparentemente inactivos y, por tanto, si se puede mejorar el rendimiento de la pleurocidina o si otras combinaciones pueden superar su potencial como terapéutico. Los ensayos de tablero de ajedrez se utilizan comúnmente para identificar ganancias sinérgicas en potencia para combinaciones de dos vías donde la inhibición del crecimiento con menos de la mitad de la cantidad de cada componente requerida para la inhibición cuando se usa solo se considera comúnmente como definición de sinergia18. Esta metodología es engorrosa e ineficaz cuando se aplica a sinergismo de tres vías o de orden superior y se ha propuesto un método elegante en el que la cantidad de un antibiótico determinado necesaria para lograr un pequeño impacto de inhibición (1%, 5% o 15%) en el crecimiento. . Cuando estas concentraciones se mezclan en combinaciones de dos vías o de orden superior, hay espacio para que se identifique una inhibición que supere la inhibición esperada de las contribuciones aditivas para al menos combinaciones de cinco vías19. Hasta donde sabemos, este método aún no se ha aplicado a los AMP.

Por lo tanto, en el presente estudio evaluamos si existe sinergia en combinaciones bidireccionales y evaluamos el método de Tekin et al. para identificar combinaciones sinérgicas de orden superior de WF AMP. Probamos si la sinergia afecta la farmacodinámica in vitro que describe su actividad bactericida y determinamos su impacto en los resultados en un modelo de infección por Acinetobacter baumannii con herida por quemadura de Galleria mellonella. Habiendo establecido que la sinergia entre los WF AMP es prevalente y beneficiosa, tanto para la EP in vitro como para la terapia in vivo, utilizamos una combinación de métodos biofísicos en estado estacionario y de resolución temporal para proporcionar información mecanicista. En particular, consideramos cómo la interacción de membrana de WF AMP seleccionados se ve afectada por la presencia de socios sinérgicos sin la formación de heterooligómeros y cómo tales interacciones podrían sustentar tanto ganancias en potencia como también una mayor cooperatividad en la acción bactericida.

Primero evaluamos el espectro de actividad antimicrobiana de los seis AMP WF, utilizando un panel de aislados bacterianos que están bien caracterizados y cuya susceptibilidad a otros AMP y antimicrobianos activos de membrana se conoce (Tabla 2)7,14,20,21,22. Debido al origen marino de los péptidos WF, también incluimos dos aislados representativos de Vibrio, V. parahaemolyticus y V. vulnificus. De acuerdo con el trabajo previo de Patrzykat et al.17, encontramos que tanto WF2 (pleurocidina) como WF1a-1 son antimicrobianos muy potentes, siendo WF2 el que muestra el espectro de actividad más amplio y WF1a-1 la mejor actividad gramnegativa (CIM 0,25). –8 µg/ml), en particular para P. aeruginosa (Tabla 2). Para explorar esto más a fondo, preparamos análogos D para mitigar la degradación proteolítica y probamos por separado su actividad frente a un panel ampliado de aislados de P. aeruginosa (Tabla complementaria 1). El rendimiento de D-WF1a-1 es mayormente comparable al de D-pleurocidina, si no un poco mejor. A diferencia de WF2, con el que comparte una identidad de secuencia sustancial (Tabla 1), la actividad antibacteriana de WF4 está restringida a bacterias Gram-negativas y también es menos activa contra Klebsiella pneumoniae y, como anteriormente17, ineficaz contra P. aeruginosa. Sin embargo, WF4 tiene una potencia notable contra A. baumannii y Vibrio spp. que no se ha descrito anteriormente. De nuevo en consonancia con trabajos anteriores17, encontramos que WF1, WF1a y WF3 están en gran medida inactivos, pero ambas cepas de A. baumannii son susceptibles a WF1, lo que resalta nuevamente la susceptibilidad general de esta especie a los AMP14,20,21.

Utilizamos tres enfoques para explorar la sinergia entre WF AMP. Primero, utilizamos el método de Tekin et al.19 para examinar la prevalencia de la sinergia bidireccional y de orden superior para los WF AMP contra K. pneumoniae NCTC 13368 como sinergia neta de Bliss o sinergia emergente (Tabla 3 y Tablas complementarias 2 y 3). ). Utilizando esta metodología, las combinaciones bidireccionales de WF1a/WF1a-1 (p = 0,002), WF1a/WF2, WF1a-1/WF3 y WF2/WF3 (todos p < 0,0001) produjeron una inhibición del crecimiento significativamente mayor que la predicha a partir de un aditivo. combinación de cada péptido y, por tanto, se consideran emergentes. Para condiciones de orden superior, la identificación de efectos emergentes, donde la sinergia es el resultado de la combinación completa en lugar de un par individual dentro de la combinación, depende de identificar la inhibición del crecimiento que supere la lograda con las combinaciones sinérgicas de orden inferior correspondientes, así como la efecto aditivo esperado. Sin embargo, la capacidad de identificar tales efectos emergentes se ve impedida en el ensayo, tal como está configurado actualmente, por la inhibición sustancial del crecimiento observada para combinaciones bidireccionales en las que están representados cada uno de cinco de los seis WF AMP (Tabla 3). Esto es cierto incluso cuando los componentes individuales no produjeron inhibición detectable cuando se usaron solos y probablemente refleja la naturaleza altamente cooperativa y rápidamente bactericida de todos los WF AMP. Mediante una medida de sinergia menos estricta, trece de veinte combinaciones de tres vías (Tabla 3), doce de quince combinaciones de cuatro vías y todas las combinaciones de seis y cinco vías producen un efecto inhibidor significativamente mayor que el aditivo (Tablas complementarias 3 y 4).

Luego buscamos identificar posibles combinaciones binarias sinérgicas para tres especies bacterianas diferentes, seleccionando aislados resistentes a antibióticos (EMRSA-15 NCTC 13616, K. pneumoniae NCTC 13368 y A. baumannii AYE) mientras validamos el enfoque utilizado anteriormente. Utilizamos un método de detección en el que se mezclaron dos WF AMP en una proporción correspondiente a sus CIM y se diluyeron en serie como en un ensayo de microdilución en caldo estándar (Tabla 4). Los dos métodos generalmente coinciden, y el análisis también identifica la sinergia entre WF1a/WF1a-1, WF1a/WF2 y WF2/WF3 contra K. pneumoniae NCTC 13368. El análisis sugiere además otra combinación (WF3/WF4) con la discrepancia atribuible a las metodologías ligeramente diferentes y a las diferentes estequiometrías utilizadas en los dos enfoques. En la evaluación de los tres aislados, se encuentra una fuerte sinergia (FIC <0,50) para nueve de quince posibles combinaciones bidireccionales de WF AMP, pero esto depende del aislado bacteriano analizado. Solo dos combinaciones producen sinergia contra los tres aislados (las combinaciones de WF1a con WF2 o WF1a-1) y otras combinaciones producen sinergia contra dos o solo uno de los aislados. Las combinaciones de WF2/WF3 y WF3/WF4 producen sinergia contra ambos aislados Gram negativos. En particular, los seis WF AMP participan en al menos una combinación sinérgica y, en cada una de las combinaciones sinérgicas de dos vías encontradas, al menos uno de los socios tiene actividad limitada o nula cuando se usa solo.

Finalmente, porque en trabajos anteriores descubrimos que un análogo de la pleurocidina con residuos de lisina reemplazados por residuos de arginina y formados por D-aminoácidos era resistente al suero que contenía medios de cultivo de células de mamíferos y eficaz en una infección pulmonar in vivo por EMRSA-15 NCTC 13616. En el modelo 14, utilizamos ensayos de tablero de ajedrez para ver si el enantiómero D de WF1a (D-WF1a) actúa en sinergia con la D-pleurocidina y/o su análogo D-pleurocidina-KR (Tabla complementaria 4). Cuando se prueba contra EMRSA-15 NCTC 13616 o P. aeruginosa RP73 en RPMI (con 5 % de FBS), se logra una fuerte sinergia (FIC <0,5) con ambas combinaciones. Sin embargo, en experimentos análogos con MHB la sinergia se debilita o se pierde y los datos son consistentes con cambios sutiles en el mecanismo de acción o la capacidad de interactuar con objetivos que impactan en la sinergia.

Arriba, consideramos el sinergismo puramente en términos de ganancias en potencia antibacteriana, pero pueden surgir otros cambios en el comportamiento de WF AMP debido a la sinergia. En trabajos realizados por otros, para combinaciones de dos y tres vías de diferentes AMP de diferentes organismos kappa, se encontró que un parámetro kappa que describe la cooperatividad de la tasa de destrucción bactericida dependiente de la dosis, determinada in vitro, aumenta en promedio para tres vías. combinaciones1. En nuestro propio trabajo, nuevamente realizado in vitro, encontramos que la cooperatividad de la actividad bactericida de temporina L contra EMRSA-15 NCTC 13616 aumentó modesta pero significativamente en presencia de otro AMP, temporina B, producido por la misma rana7. Sin embargo, la ganancia de potencia proporcionada por la combinación sinérgica de las temporinas es débil y la cooperatividad es menor que la lograda por la pleurocidina (WF2) sola en las mismas condiciones7.

Por lo tanto, en el presente estudio probamos si el perfil de PD in vitro de WF2 se ve afectado por sus socios sinérgicos mucho menos potentes WF1a o WF3 y lo comparamos con la acción de otra combinación de WF AMP, WF3/WF4, así como con antibióticos bactericidas relevantes. contra tres aislados bacterianos diferentes en dos condiciones diferentes (Fig. 1). Todos los WF AMP y todas las combinaciones de WF AMP producen una actividad bactericida sustancialmente más rápida que cualquiera de los antibióticos clínicamente utilizados probados: los AMP matan en minutos y los antibióticos en horas (Figura 1 complementaria), y esto se refleja en las tasas netas de crecimiento bacteriano ( Figuras 1a, c, e). La tasa de destrucción máxima se logra en o dentro de dos veces el MIC para ATCC 17978 (Fig. 1a), y aprox. diez veces el MIC para AYE (Fig. 1c) y EMRSA-15 NCTC 13616 (Fig. 1e). Con la excepción de la gentamicina para A. baumanii 17978, que es comparable a todos los AMP y combinaciones de AMP, y la daptomicina en EMRSA-15 NCTC 13616, que no es inferior a WF2 (pero sí a D-WF2 y la combinación de D-WF2 /D-WF1a), esta comparación también es válida para la cooperatividad de la actividad dependiente de la dosis, que generalmente es mucho mayor para los WF AMP que lo que se observa para los antibióticos clínicamente utilizados (Fig. 1b, d, f).

Ensayos farmacodinámicos in vitro realizados para péptidos WF seleccionados y combinaciones de los mismos, y antibióticos bactericidas clínicamente relevantes a los que cada cepa sigue siendo susceptible: A. baumannii ATCC 17978 en MHB (a, b), A. baumanii AYE en MHB (c, d) o EMRSA-15 NCTC 13616 en RPMI con 5 % de FBS (e, f) fueron expuestos a concentraciones crecientes de WF AMP, combinaciones de WF AMP o antibióticos clínicamente relevantes. Las curvas mostradas son ajustes de promedios de tres experimentos repetidos independientes (a, c, e) y muestran el cambio en la tasa bactericida en función de la dosis, reportada como fracciones o múltiplos de la MIC (×MIC). El ANOVA unidireccional con comparaciones múltiples de la prueba post hoc de Tukey para Kappa (b, d, f), resalta las diferencias en la cooperatividad entre los WF AMP, sus combinaciones y los antibióticos. Se muestran la media y el SE de tres experimentos repetidos independientes. Sólo se muestran comparaciones significativas por pares entre AMP o entre antibióticos utilizados clínicamente (las comparaciones entre AMP y antibióticos se proporcionan en el texto principal): *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001. En el material complementario se proporcionan curvas de tiempo muerto seleccionadas, utilizadas para construir las curvas de PD en a, (Figura 1 complementaria).

Dado que WF1a y WF3 tienen una potencia antibacteriana relativamente débil, no realizamos experimentos de PD in vitro solo para estos péptidos. Por lo tanto, es discutible si la cooperatividad de la actividad bactericida de las combinaciones simplemente refleja la del compañero menos potente o es una propiedad emergente de la combinación. Sin embargo, en cada uno de los tres experimentos separados, la presencia de WF1a o su enantiómero D junto con pleurocidina/WF2 o su enantiómero D conduce a un aumento en la cooperatividad de la potente y útil actividad bactericida (Fig. 1b, d, f ). La presencia de WF3 tiene un efecto similar sobre la cooperatividad contra A. baumannii AYE (Fig. 1d) cuando está presente con WF2 o WF4, pero esto no se observa en ATCC 17978 (Fig. 1b). Otras observaciones incluyen: (1) si bien la tasa máxima de destrucción bactericida no se ve afectada, la cooperatividad observada para los WF AMP y sus combinaciones es generalmente menor para A. baumannii AYE, más resistente a los antibióticos (Fig. 1c, d), en comparación con los más antibióticos. ATCC 17978 susceptible (Fig. 1a, b) y; (2) existe una mayor cooperatividad en la acción bactericida del enantiómero D de pleurocidina/WF2 contra EMRSA-15 NCTC 13616 (en RPMI con 5% de FBS) en comparación con la del enantiómero L (Fig. 1e, f) .

Habiendo establecido ganancias tanto en potencia como en cooperatividad al combinar WF AMP, intentamos establecer si esto se traducía en ganancias en eficacia terapéutica en una infección de herida por quemadura de invertebrados (Fig. 2 y Tabla 5). Recientemente se han utilizado larvas de la polilla mayor de la cera, Galleria mellonella, para establecer un modelo de infección de heridas por quemaduras en invertebrados23. Utilizando este modelo, hemos demostrado la terapia con combinaciones sinérgicas de gentamicina y bolalípidos y establecido que la gentamicina (5 mg/kg), utilizada en todo el mundo para el tratamiento de quemaduras infectadas, tiene un efecto protector como monoterapia22. Aquí, la gentamicina se compara favorablemente con las otras tres intervenciones con antibióticos (Fig. 2a y Tabla 5), ​​y el orden de éxito terapéutico (gentamicina > ciprofloxacina > imipenem > meropenem) es el mismo que el orden de la tasa máxima de destrucción bactericida (Fig. 1a).

Se trazan curvas de supervivencia para treinta larvas, cada una de ellas tratada con antibióticos clásicos (a), WF2 (pleurocidina) (b), combinaciones de WF2 y WF3 o WF1a (c), o WF3 y/o WF4 (d), en cada caso. en comparación con cincuenta larvas sometidas a quemadura únicamente o quemadura más infección (A. baumannii ATCC 17978) durante 96 h. El porcentaje de supervivencia junto con las pruebas de significancia de protección contra la infección, debido a la terapia, según las pruebas de Log-rank (Mantel-Cox) o Gehan-Breslow-Wilcoxon se muestran en la Tabla 5.

Una dosis intermedia de 10 mg/kg de WF2 (pleurocidina) ofrece una protección similar a la lograda con 5 mg/kg de gentamicina, pero dosis inferiores (2,5 mg/kg) o superiores (20 mg/kg) de pleurocidina no ofrecen una protección significativa (Fig. .2b y Tabla 5). Por el contrario, se logran niveles de protección similares a los proporcionados por la gentamicina con dosis bajas (2,5 mg/kg) de WF2 cuando se combinan con WF1a (50 mg/kg) o WF3 (20 mg/kg), y estos dos AMP no proporcionan ningún efecto. protección cuando se usa solo (Fig. 2c y Tabla 5). Curiosamente, una combinación de 20 mg/kg de WF3 y 5 mg/kg de WF4 proporciona una protección completa cuando el uso de cualquiera de estos AMP por sí solo no proporciona ninguna (Fig. 2d y Tabla 5).

Habiendo establecido que la sinergia entre los WF AMP conduce a ganancias en potencia, un perfil farmacodinámico mejorado y resultados terapéuticos, preguntamos si podíamos obtener información a nivel molecular sobre cómo esto podría efectuarse. Es notable que WF2 y WF4 y, por separado, WF1 y WF1a comparten identidades y similitudes de secuencia sustanciales (Tabla 1) y, sin embargo, difieren manifiestamente en sus propiedades antibacterianas y su capacidad para participar en combinaciones sinérgicas. Dado que un solo AMP es incapaz de formar un poro en la membrana lipídica por sí solo, algunos consideran que la formación de agregados de AMP es esencial para su actividad24, y la sinergia para otros AMP se ha explicado, al menos en parte, por la formación de heterooligómeros7. 25,26,27,28,29. Por lo tanto, llevamos a cabo un estudio biofísico de la conformación y estructura de WF AMP, así como de sus interacciones con modelos de membranas plasmáticas bacterianas para caracterizar y comprender mejor las diferencias en su comportamiento e identificar aspectos que podrían contribuir al sinergismo.

Todos los péptidos WF tienen el potencial de adoptar conformaciones con anfipaticidad secundaria y tienen una longitud similar (Tabla 1). De los seis péptidos, WF3 es notablemente más hidrófobo que los otros cinco péptidos, en particular en el extremo N. WF2, WF3 y WF4 se vuelven más hidrófilos a pH ácido, mientras que WF1, WF1a y WF1a-1, por el contrario, se vuelven más hidrófobos. Los seis péptidos se vuelven más catiónicos a un pH más bajo. Los seis péptidos son notablemente ricos, no sólo en residuos básicos e hidrofóbicos, como es común en los AMP anfipáticos catiónicos, sino también en glicina, un aminoácido conocido por confiere flexibilidad conformacional.

Anteriormente hemos demostrado que la pleurocidina adopta conformaciones de hélice α anfipática pero está menos ordenada y/o se caracteriza por una flexibilidad conformacional sustancial en modelos que reflejan con mayor precisión la membrana plasmática ordenada13,14,30. Aquí presentamos cuatro pruebas de que la pleurocidina y los otros péptidos WF pueden adoptar conformaciones tanto de hélice α como de PII (poliprolina-II).

Primero, utilizamos dicroísmo circular (CD) de UV lejano para estudiar la conformación de los seis WF AMP en solución acuosa en función de la temperatura (Figura complementaria 2). Los espectros obtenidos a temperaturas más bajas son superficialmente característicos de una conformación desordenada, pero al calentarlos hay un cambio sustancial en los espectros de los seis AMP, lo que sugiere que a temperaturas más bajas hay contribuciones a los espectros CD desde alguna estructura secundaria ordenada o semiordenada. . En particular, la intensidad de la banda negativa a 197 nm disminuye casi a la mitad, mientras que una protuberancia prominente a alrededor de 220 nm también disminuye. Estas características son características de la conformación de PII incluso si son más prominentes en los péptidos modelo31. Los espectros obtenidos a temperaturas más bajas son, por tanto, característicos de una mezcla de conformaciones desordenadas y PII, reduciéndose esta última con el calentamiento.

En segundo lugar, utilizamos CD de UV lejano para estudiar la conformación de los WF AMP en tres modelos de membranas plasmáticas bacterianas (Fig. 3a-c). En las micelas aniónicas de dodecil sulfato de sodio (SDS), los espectros de CD de los seis WF AMP comparten características de conformaciones ordenadas de hélice α con una banda positiva prominente a 195 nm y bandas negativas a 208 y 222 nm (Fig. 3a). Sin embargo, estos no son tan prominentes como los observados para la temporina L, un AMP con una fuerte preferencia por la conformación de hélice α, y estas diferencias se amplifican cuando se realizan los mismos experimentos en bicapas lipídicas que modelan respectivamente Gram-positivos (Fig. 3b) o Membranas plasmáticas gramnegativas (Fig. 3c). La reducción en la intensidad de estas características es consistente tanto con un mayor desorden de la conformación de la hélice α como con cierta adopción de la conformación de PII con la banda positiva a 220 nm y la banda negativa a 197 nm esperadas para PII que se oponen a las características espectrales asociadas con la hélice α. . Nuevamente, la comparación con los espectros de CD obtenidos para temporin L en las mismas condiciones es clara (Fig. 3b, c).

Espectros de dicroísmo circular de UV lejano de péptidos de platija de invierno 50 µM o temporina L en tampón Tris 5 mM a pH con micelas SDS 5 mM (a) o 15 µM en modelos de Gram positivos (POPG—b 3 mM) o Gram negativos. (3 mM POPE:POPG (75:25)—c) membranas plasmáticas bacterianas a 37 °C. Los espectros son representativos de tres experimentos repetidos de forma independiente. Una comparación de los anchos de línea de los picos cruzados de HN con HA NOESY (media y DE) para WF AMP y temporina L (TL) en SDSd25 revela anchos de línea mucho mayores para los péptidos de WF, lo que indica un intercambio intermedio (d). Las estructuras recientemente resueltas de los WF AMP son probablemente híbridos de al menos dos conformaciones adoptadas en SDS (f) y se identifican proporciones más bajas de conformación de hélice α en relación con estructuras previamente resueltas de WF2 (2LS9) y, en particular, temporina L (6GS5). (mi). Los segmentos son de color violeta para hélices α, azul para hélices de 3 a 10 y cian y blanco respectivamente para espiras y bobinas. Sin embargo, tenga en cuenta que Definir la estructura secundaria de proteínas (DSSP) es incapaz de identificar la conformación de PII. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni: *p < 0,05; **p < 0,01; ****p < 0,0001.

En tercer lugar, resolvimos las estructuras de WF1, WF1a, WF1a-1, WF3 y WF4 en micelas SDS utilizando espectroscopia de RMN 2D 1H-1H NOESY (Fig. 3f). En particular, los anchos de línea de media altura para, por ejemplo, las correlaciones HN-HA son mucho mayores de lo esperado y significativamente en comparación con los obtenidos para temporin L (Fig. 3d). Anchos de línea tan grandes son consistentes con un intercambio lento a intermedio en la escala de tiempo de RMN. En estos escenarios, los cambios químicos conformacionalmente dependientes de dos poblaciones de confórmeros diferentes se superponen y/o los péptidos cambian de una conformación a otra en la misma escala de tiempo que el experimento de RMN, por lo que se toman muestras de ambos confórmeros. De acuerdo con esto, los NOE ii + 4 son detectables pero débiles y no se extienden a lo largo de la secuencia peptídica (Figura complementaria 3) y, por lo tanto, aunque un motivo en espiral es evidente en los modelos estructurales resultantes, mucho menos hélice α o 3-10 La hélice se detecta en comparación con estructuras previamente resueltas de temporin L o incluso pleurocidina (Fig. 3e).

Finalmente, realizamos simulaciones de dinámica molecular atomística (MD) de 200 ns por triplicado de cuatro de cada WF AMP que se unen e insertan en bicapas que comprenden 512 POPG o 384 POPE y 128 POPG lípidos que modelan, respectivamente, membranas plasmáticas Gram positivas y Gram negativas. Luego evaluamos el enlace H intramolecular y, durante los últimos 20 ns de cada simulación, los ángulos promedio de Ramachandran para cada péptido (Figura 4 complementaria). De acuerdo con los estudios estructurales de RMN, se detectan relativamente pocos enlaces de hidrógeno intramoleculares ii + 4 (o ii + 3) (Figura complementaria 4). Nuevamente, aunque los WF AMP WF1 y WF2 tienen un mayor número de enlaces de hidrógeno ii + 4, en POPE/POPG esto queda eclipsado por la medida equivalente para la temporina L fuertemente α-helicoidal (Figura complementaria 4B). Los menos enlaces de hidrógeno intramoleculares de los WF AMP en relación con la temporina L no se compensan con un aumento de los enlaces de hidrógeno entre péptidos y lípidos, incluso si tal efecto se observa al reemplazar los residuos de lisina en WF2 con arginina para crear pleurocidina-KR (Figura complementaria 4C). Los gráficos de Ramachandran para WF1a y WF2 (Fig. 4D, E complementaria) ejemplifican los observados para los otros WF donde los péptidos individuales ocupan regiones consistentes con la hélice α (φ −60°; ψ −45°) y PII (φ −75°; ψ +150°) conformaciones. Como se estableció previamente para la pleurocidina30, la flexibilidad conformacional de los WF AMP, determinada por la varianza circular de φ y ψ, es relativamente alta, particularmente en comparación aquí con, por ejemplo, la temporina L (Figuras complementarias 5A, B). Sin embargo, aunque la flexibilidad conformacional de φ para WF1a se reduce cuando se combina con WF2 o pleurocidina-KR (Figuras complementarias 5C, D), como lo ejemplifican WF1a y WF2 (Figura complementaria 4F), todavía se observan diferentes péptidos individuales de WF que adoptar ambas conformaciones en combinaciones sinérgicas.

Al analizar más a fondo las simulaciones de MD, consideramos si existen diferencias en la penetración de los WF AMP que puedan explicar sus diferentes potencias (Fig. 4). Es de destacar que los seis WF AMP y la pleurocidina-KR penetran más fácilmente en la bicapa de POPG en comparación con la bicapa de POPE/POPG, un efecto que no se observa para la temporina L (Fig. 4c). En POPG, WF2 alcanza el nivel de los fosfatos lipídicos (Fig. 4a) y la pleurocidina-KR logra una penetración similar, pero también WF3 y WF4, con una penetración de WF1, WF1a y WF1a-1 significativamente menor (Fig. 4c). En las bicapas POPE / POPG, WF2 alcanza la región interfacial justo encima de los fosfatos lipídicos (Fig. 4b) y esto es similar para todos los péptidos excepto WF1.

Instantáneas de vista lateral para WF2/pleurocidina después de 200 ns en bicapas POPG (a) o POPE/POPG (b); para mayor claridad, solo se muestran los átomos de fósforo para los lípidos. El centro de masa (COM) se muestra como promedios de los cuatro péptidos en cada simulación durante los últimos 100 ns en cada una de tres (WF y pleu-KR) o dos (temporin L) replican simulaciones de 200 ns (c). Se muestran la media y el SE para las réplicas. ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

De hecho, de los tres WF AMP que carecen de potencia antibacteriana cuando se usan solos, WF1 penetra significativamente menos en cualquiera de las bicapas que cualquiera de los otros péptidos, pero WF3 penetra fácilmente y WF1a penetra tanto como su análogo mucho más potente, WF1a-1, incluso si menos que WF2 en POPG (Fig. 4c).

Para evaluar el impacto en las bicapas de la penetración del péptido, calculamos los parámetros del orden de la cadena de acilo lipídico para los lípidos dentro de 4 Å de cada péptido insertado. Para las bicapas de POPG, todos los WF AMP inducen un mayor desorden (Figura complementaria 6A). En las bicapas mixtas POPE/POPG, el desorden del componente aniónico PG debido a los WF AMP es similar en el núcleo hidrófobo (entre los carbonos 6 y 14), pero el WF2 (pleurocidina) altera las cadenas de acilo más que los otros WF AMP en la región más cercana. al grupo principal (Figura complementaria 6B). El efecto desordenante es generalmente mayor para el componente PE y es similar para todos los WF AMP, excepto WF3, que induce un mayor desorden en el núcleo hidrófobo (Figura complementaria 6C).

En simulaciones anteriores de ocho péptidos de temporina L que se unen a las mismas bicapas utilizadas en el presente estudio, observamos ensamblajes duraderos de tres, cuatro o cinco péptidos7. Aquí, con la mitad de péptidos en cada simulación, la formación de ensamblajes es menos probable, aunque todos los WF AMP, excepto WF3, forman al menos un dímero durante al menos 50 ns (Figuras complementarias 7 y 8). Los ensamblajes son menos probables para pleurocidina-KR en relación con WF2, pero más probables para WF4 y WF1a, con un trímero de larga duración formándose en una simulación de WF1a (Figura complementaria 7). Aunque WF3 evita la agregación cuando no está mezclado, en combinación se forma un trímero y perdura en una simulación, lo que indica que los heterooligómeros son posibles (Figura complementaria 8A). Por lo tanto, los WF AMP pueden ensamblarse en dímeros, pero los ensamblajes de orden superior son raros con la densidad de superficie peptídica actual.

Para determinar si alguna de las propiedades descritas anteriormente se altera cuando los WF AMP están presentes en combinaciones sinérgicas, se realizaron simulaciones MD análogas donde se mezclaron dos de cada WF AMP según las siguientes combinaciones: WF1a/WF2 en bicapas POPE/POPG (Fig. 5). ); WF1a/WF2 y WF1a/pleurocidina-KR en bicapas POPG y WF1a/pleurocidina-KR, WF2/WF3 y WF3/WF4 en bicapas POPE/POPG (Figuras complementarias 9-13).

Centro de análisis de masas donde cada punto es un péptido en una de las tres simulaciones replicadas, la barra es la media y el error es SE (a). Instantánea de vista lateral para WF1a/pleurocidina después de 200 ns (c). Los parámetros del orden de las cadenas de acilo lipídico para lípidos dentro de 4 Å de un péptido se muestran como promedios de las tres réplicas para POPE (b) o POPG (d) en bicapas mixtas de POPE/POPG. La distribución de enlaces de hidrógeno para WF1a (e, f) o WF2 (g, h) se ejecuta sin mezclar (e, g) o como combinaciones (f, h). Cada panel es una suma de cuatro péptidos cuando los péptidos no están mezclados o dos péptidos cada uno para las combinaciones y es representativo de n = 3 réplicas. ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples de Šídák: **p < 0,01.

Esto mantiene el número total de WF AMP que desafían cada bicapa (cuatro), pero reduce el número de cada tipo de WF AMP en cada simulación. Mientras que la penetración de los WF AMP, cuando no están mezclados, es muy consistente entre las simulaciones replicadas (Fig. 4c), cuando se combinan, la penetración se vuelve más variable entre las réplicas y entre los péptidos en cada simulación. Si bien algunos AMP de WF2 penetran la bicapa POPE/POPG en la misma medida que cuando no están mezclados, algunos péptidos penetran mucho más en la bicapa en presencia de WF1a (Fig. 5a), y parte del péptido penetra por primera vez más allá del plano. de los fosfatos (Fig. 5b). Se observa el mismo efecto para la combinación de WF1a y pleurocidina-KR en bicapas de POPG (Fig. 9A complementaria) con un comportamiento similar observado para WF2 con WF1a en POPG (Fig. 9A complementaria) y pleurocidina-KR y WF1a en POPE/POPG ( Fig. complementaria 10B) incluso si no hay un aumento significativo en la penetración promedio. La penetración de POPE/POPG por WF2 no se ve afectada por la presencia de WF3 de la misma manera (Figura complementaria 12A), pero WF4 penetra más cuando se combina con WF3 (Figura complementaria 13A), llegando por debajo del plano de fosfato lipídico (Figura complementaria .13C).

Para las combinaciones de WF1a/WF2 y WF2/WF3, el desorden de los lípidos POPG pero no de POPE se atenúa (Fig. 5b, d y Fig. Suplementaria 12B, D), con un efecto similar pero menos pronunciado para WF1a/pleurocidina-KR ( Figura complementaria 11B, D). El trastorno inducido por la combinación WF3/WF4 es muy similar al logrado por los péptidos sin mezclar (Figuras complementarias 13B, D), al igual que el logrado con las combinaciones WF1a/WF2 y WF1a/pleurocidina-KR en POPG (Figuras complementarias 9B). y 11A).

Para comprender mejor el mecanismo que sustenta estos cambios en el comportamiento, consideramos cómo los WF AMP interactúan con las bicapas cuantificando los enlaces de hidrógeno péptido-lípido por residuo a lo largo del tiempo (Figs. 5e-h y Fig. complementarias 9, 10, 12 y 13). Si bien el número total de enlaces de hidrógeno entre el péptido y los lípidos no cambia entre las condiciones sin mezclar y combinadas, el patrón observado para WF2 mientras se inserta en las bicapas POPE/POPG en la combinación se altera sustancialmente, mientras que el de WF1a no se ve afectado (Fig. 5e). –h). En particular, las fuertes interacciones entre los lípidos y His11 y Lys14 en particular y también Lys8 e His15, que son características de la inserción de WF2 cuando no se mezclan (Fig. 5g), están ausentes o disminuidas cuando se combinan con WF1a (Fig. 5h). Por el contrario, los enlaces de hidrógeno en el extremo C (Thr22, His23, Tyr24) aumentan (Fig. 5g, h).

El mismo efecto se observa para la inserción de WF2 en bicapas de POPG en presencia/ausencia de WF1a (Figuras complementarias 9C-F) y para el análogo pleurocidina-KR que se inserta en cualquiera de las bicapas, nuevamente en presencia de WF1a (Figuras complementarias 10C- J). Para la pleurocidina-KR, el efecto es más dramático debido al potencial de enlace de hidrógeno más fuerte de sus cuatro argininas sobre las lisinas originales en WF2/pleurocidina. Por lo tanto, la presencia de WF1a altera el patrón de enlaces de hidrógeno péptido-lípido de cualquier péptido que se base en la plantilla de pleurocidina. Curiosamente, el patrón de enlaces de hidrógeno de WF2 también se ve afectado por la presencia de WF3 (Fig. 12E – H complementaria) y se observa el mismo efecto para WF4 con el que WF2 comparte una identidad y similitud de secuencia sustancial (Fig. 13E – H complementaria).

En ambos casos, el patrón de enlaces de hidrógeno observado para WF3 no se ve afectado por la presencia de WF2 o WF4, pero para ambos péptidos la presencia de WF3 conduce a una mejora sustancial de los enlaces de hidrógeno mediados por Gly13/Lys14 (WF2) o Ala13/. Lys14 (WF4) a expensas de otras interacciones que dominan cuando los péptidos no están mezclados. Como tal, las simulaciones de MD revelan que los WF AMP menos activos pueden modular el mecanismo por el cual los WF AMP más activos interactúan con las bicapas lipídicas, pero hasta el momento no hay evidencia de lo contrario.

Finalmente, investigamos si la comprensión a nivel atómico de la interacción de la membrana WF AMP proporcionada por las simulaciones MD podría estar relacionada con efectos que podrían asociarse más fácilmente con la actividad bactericida y el grado en que la actividad de la membrana puede explicar la potencia y la sinergia antimicrobiana. De hecho, a pesar de la capacidad de la pleurocidina para penetrar dentro de las bacterias y alcanzar objetivos intracelulares11,12, tiene propiedades disruptivas de la membrana bien establecidas9,32, y tanto el daño a la membrana como los comportamientos de penetración pueden revelarse mediante mediciones apropiadas de conductancia iónica.

En los experimentos de patch-clamp, nuestro enfoque ha sido valorar el péptido para encontrar la concentración umbral más baja capaz de desencadenar la conductancia iónica y luego caracterizar esta actividad de membrana tanto cualitativa como cuantitativamente7,14,20,21. Curiosamente, esta concentración umbral, obtenida para los WF AMP que desafían los lípidos difitanoilo, se correlaciona con el desorden promedio de los correspondientes lípidos palmitoil-oleoilo en las simulaciones de MD (Fig. 6a). Puede existir una relación similar pero más débil entre la penetración (COM) y la concentración umbral (r de Spearman = 0,5593, p = 0,0634), pero no existe relación entre la concentración umbral y las CIM promedio para aislados Gram positivos o Gram negativos (Fig. 6b). Por lo tanto, si bien las mediciones de conductancia iónica parecen sensibles a las variaciones en la capacidad del WF para penetrar y alterar los lípidos en las bicapas modelo, tales diferencias no explican las diferentes potencias antibacterianas.

El desorden de las cadenas de lípidos acilo inducido por WF AMP en simulaciones de MD está relacionado con la concentración más baja a la que se detecta la conductancia iónica mediante parche-clamp (a Pearson r = 0,7007, p = 0,0111). En estas concentraciones, solo algunos WF AMP desencadenan una actividad sustancial de la membrana (f DPhPG; g DPhPE/DPhPG) y las CIM promedio para bacterias Gram positivas o Gram negativas no están relacionadas con estas concentraciones umbral (b Pearson r = 0,4802; p = 0,1141; guión rojo = línea de identidad). En su concentración umbral (7,5 µM), WF2, d, g induce una conductancia iónica sustancial en las bicapas DPhPE/DPhPG, pero esto es lento (d, h) y precede a la ruptura de la bicapa. WF1a (15 µM) es en gran medida inerte (c, g). La combinación de WF2 (3,75 µM) y WF1a (5 µM) garantiza que se induzca una conductancia iónica sustancial más rápidamente y con menos péptido (e, g, h). El tiempo necesario para el inicio de la conductancia (h) es el promedio y el SE de cinco réplicas independientes. ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni: ***p < 0,001.

Se obtiene una mejor comprensión cuando se considera la naturaleza de la actividad observada en las concentraciones umbral, ya que existe una variación sustancial en el tipo de actividad, la frecuencia de los eventos de conductancia, la magnitud de la conductancia y también la velocidad con la que comienza la actividad después del desafío, según al WF AMP aplicado (Fig. 6c – h y Fig. complementaria 14). Al desafiar las bicapas de DPhPG, el modelado de membranas plasmáticas de bacterias Gram-positivas, WF1, WF1a y WF4 tienen poco impacto (Fig. 6f), mientras que el inicio de la actividad de WF3 es muy lento (Fig. 14A complementaria). Las bicapas DPhPE / DPhPG son generalmente más resistentes a la conductancia inducida por WF AMP y solo WF1a-1, WF4 y WF2 inducen muchos eventos de conductancia de alta amplitud (Fig. 6g), mientras que la actividad inducida por WF2 tarda en comenzar (Fig. 6d y Figura complementaria 14B). Dado que sólo estos péptidos tienen una actividad potente contra las bacterias Gram negativas, estas observaciones son consistentes con las potencias antibacterianas relativas de los WF AMP descritas anteriormente.

Luego nos centramos en si la sinergia entre WF1a y WF2 puede explicarse por cambios en la conductancia de los iones. WF1a tiene muy poco impacto en su concentración umbral (Fig. 6c, g), pero cuando se combina con WF2, incluso en concentraciones más bajas, la conductancia de iones es sustancial (Fig. 6e), con muchos más eventos de conductancia de alta amplitud (Fig. 6g). y la actividad comienza consistentemente mucho más rápidamente (Fig. 6h), siendo esta última una propiedad emergente ya que, aunque esto no es significativamente más rápido que cuando se usa WF1a solo (p = 0.0658), WF1a solo no induce conductancia que estaría asociada con actividad bactericida.

En el presente estudio, mostramos que la sinergia entre los AMP encontrados en Winter Flounder aumenta la potencia, mejora la cooperatividad en la farmacodinámica de la actividad bactericida y mejora los resultados terapéuticos en un modelo de infección de heridas por A. baumannii. Además, presentamos un primer examen de algunos de los mecanismos que pueden sustentar la sinergia y brindamos información sobre cómo los WF AMP menos activos (WF1a o WF3) pueden modular la interacción de membrana de WF AMP más activos (WF2/pleurocidina o WF4). Si bien la terapia exitosa de quemaduras infectadas en un modelo de infección de invertebrados plantea la posibilidad de trasladar esto a modelos de mamíferos y, en última instancia, a la clínica, quedan preguntas más fundamentales. Estos incluyen si los WF AMP pueden participar en una sinergia emergente en combinaciones de orden superior y en qué medida las variaciones en el medio ambiente, las especies bacterianas y las cepas podrían afectar la cooperatividad en la actividad bactericida y si esto efectivamente afecta el riesgo y/o la frecuencia de la resistencia.

La identificación de numerosas combinaciones sinérgicas bidireccionales de WF AMP se puede lograr utilizando el enfoque elegante y eficiente de Tekin et al. y una microdilución en caldo simple de WF AMP emparejados según sus MIC individuales. En contraste con Tekin et al., no podemos identificar combinaciones sinérgicas emergentes de orden superior, pero esto puede reflejar la alta cooperatividad rápidamente bactericida y de la actividad AMP. El enfoque depende de la identificación de dosis de antibióticos que conduzcan a reducciones pequeñas pero mensurables en el crecimiento, de modo que incluso con combinaciones de orden superior, se pueda identificar el sinergismo emergente siempre que las combinaciones de orden inferior no generen una inhibición completa19. Sin embargo, debido a la alta cooperatividad de los AMP, es posible lograr un cambio drástico en la actividad bactericida con sólo un pequeño cambio en la concentración de AMP. De hecho, es posible que se observe una inhibición cero con WF AMP individuales y que se encuentre una inhibición casi total con solo combinaciones de dos vías y aquí mostramos que la cooperatividad aumenta incluso con combinaciones de dos vías. Como tal, probablemente necesitaremos un enfoque diferente para identificar una sinergia de orden superior entre los AMP, siendo el método ideal un alto rendimiento y capaz de proporcionar datos dependientes de la dosis y resueltos en el tiempo para tener en cuenta cualquier cambio emergente en la tasa de eliminación de bactericidas.

Mientras tanto, sin embargo, las simulaciones MD sugieren combinaciones de tres vías que deberían investigarse más a fondo. En particular, las simulaciones de MD revelan que los patrones de enlaces de hidrógeno péptido-lípido de WF2/pleurocidina y WF4 se ven afectados de manera similar por la presencia de WF3 y, por lo tanto, surge la pregunta de si WF3 puede afectar ambos péptidos simultáneamente y cuál será el resultado de tener estos dos efectos en paralelo. Por el contrario, los efectos de WF1a y WF3 sobre el patrón de enlaces de hidrógeno péptido-lípido de WF2/pleurocidina difieren sustancialmente. Como tal, surge la pregunta de si estos efectos podrían competir o si emerge algún otro comportamiento. En particular, tanto WF2 como WF3 se expresan en las branquias de la platija invernal (junto con WF1)33, y WF2, WF3 y WF1a se expresan en el intestino y esto plantea la pregunta de cómo el ambiente y/o las diferencias en la amenaza bacteriana dan forma a la función de diferentes combinaciones sinérgicas. No se encontró expresión de WF4 en la piel o el intestino de adultos, pero no se tomaron muestras de otros tejidos y etapas de la vida y no hubo ninguna agresión patógena que pudiera desencadenar la expresión33. Por lo tanto, el papel fisiológico del WF4 y las combinaciones en las que podría participar siguen siendo difíciles de alcanzar por ahora. Sin embargo, parece probable que la coexpresión de WF2 con WF1a y/o WF3 in situ pueda generar ganancias para el sistema inmunológico innato de Winter Flounder en términos de potencia antibacteriana, lo que puede traducirse en una mayor selectividad y una reducción del daño colateral en el sitio de la infección. Además, aunque aún no se ha probado, según la teoría avanzada por Rolff y otros1,2,34, el aumento de la cooperatividad de la acción bactericida obtenida al combinar diferentes WF AMP puede limitar el desarrollo de resistencia a la inmunidad innata de la platija invernal. respuesta.

En el presente estudio, podemos establecer que los WF AMP poco activos, como WF3 o WF1a, son capaces de modular la interacción de membrana de WF AMP más activos, como WF4 o WF2/pleurocidina. Además, mostramos que solo aquellos WF AMP que inducen una actividad sustancial de la membrana en sus concentraciones umbral tienen una potente actividad antibacteriana y que esta actividad se potencia y acelera en dosis más bajas de WF2/pleurocidina por WF1a. Este efecto probablemente explica la ganancia sinérgica de potencia observada en esta combinación y, sin embargo, las CIM gramnegativas tanto para WF2 como para WF1a-1 están muy por debajo de la concentración umbral en parche-clamp. Esto indicaría que hay más en el mecanismo bactericida que la alteración de la membrana para ambos péptidos y también que para algunas especies bacterianas la alteración de la membrana es una estrategia bactericida menos eficaz. Por lo tanto, dado que la capacidad de WF2/pleurocidina para penetrar bacterias y alterar objetivos intracelulares está bien establecida para WF2/pleurocidina11,12,13, y no existe ningún estudio similar para WF1a-1, existe la necesidad de investigar las contribuciones no relacionadas con la membrana a potencia y sinergia con más profundidad para comprender completamente el efecto.

Si bien los efectos del WF AMP más allá de la membrana plasmática bacteriana también pueden influir en la cooperatividad de la acción bactericida (de hecho, la alta cooperatividad de la gentamicina observada aquí es consistente con la alta cooperatividad de su unión a dos de las tres clases de sitios de unión en el ribosoma 70 S35), la capacidad de simulaciones MD para identificar la modulación de la unión e inserción de WF4 y WF2/pleurocidina en modelos de la membrana plasmática, por WF1a y/o WF3 sugiere que esta técnica puede revelar al menos parte de cómo se altera la farmacodinámica bactericida en combinaciones bidireccionales. La cooperatividad mejorada en la actividad bactericida en combinaciones sinérgicas de dos vías requiere una inhibición relativa de la actividad a concentraciones bajas de AMP y una mejora de la actividad a concentraciones más altas. Las características que podrían respaldar cada uno de estos efectos se observan en la concentración única probada aquí, en particular la perturbación del patrón de enlace de hidrógeno péptido-lípido observado para WF2/pleurocidina y WF4 en condiciones sin mezclar, pero también la mayor penetración de WF2 (con WF1a) y WF4 (con WF3). Por lo tanto, los cambios dependientes de la dosis en este comportamiento pueden proporcionar una comprensión mecanicista de la importancia de estos efectos y pueden combinarse con estudios dependientes de la dosis y resueltos en el tiempo sobre la despolarización de la membrana plasmática y la alteración del objetivo intracelular para obtener una comprensión integral de la cooperatividad y la velocidad de la acción bactericida.

También mostramos aquí que la capacidad de adoptar conformaciones tanto de hélice α como de poliprolina-II en entornos de membrana es una característica distintiva de los WF AMP. Sin embargo, aún no se comprende su importancia ya que, aunque los WF AMP pueden penetrar bicapas ricas en fosfatidilglicerol más fácilmente que otros AMP que adoptan sólo conformaciones de hélice α, todavía tenemos que establecer algún beneficio particular de la conformación PII o la capacidad de intercambiar entre ellas. las dos conformaciones o cualquier cambio en este comportamiento en combinaciones de WF AMP (más allá de una modesta reducción en la flexibilidad para WF1a).

Al comparar la cooperatividad de la actividad bactericida de WF AMP entre especies bacterianas y entre diferentes cepas de A. baumannii, podemos demostrar que la farmacodinamia antibacteriana de los AMP estará fuertemente influenciada por la naturaleza del objetivo bacteriano. La farmacodinámica de la acción bactericida puede mejorar o deteriorarse después de la adaptación del antibiótico36, y el origen de la menor cooperatividad observada aquí para los WF AMP contra la cepa AYE más resistente a los antibióticos, en relación con A. baumannii ACTCC 19778, justifica una mayor investigación.

En resumen, encontramos que la sinergia puede mejorar la potencia y la farmacodinamia bactericida de los AMP del mismo organismo y expresados ​​en el mismo tejido y esto mejora la terapia. Sin embargo, el perfil de PD puede variar según la especie y/o cepa y es necesario identificar las contribuciones tanto de las bacterias como de su entorno y de los propios AMP para comprender cómo se manipula la PD. Con tal comprensión, se puede realizar una investigación para determinar si un perfil variable de EP está realmente relacionado con el riesgo de resistencia y cómo se pueden apreciar plenamente los beneficios.

Todos los péptidos se adquirieron de Cambridge Research Biochemicals (Cleveland, Reino Unido) como grado desalado (crudo). Los péptidos crudos se purificaron adicionalmente usando gradientes de agua/acetonitrilo usando una columna Waters SymmetryPrep C8, 7 µm, 19 x 300 mm. Todos los péptidos fueron amidados en el extremo C-terminal. Los lípidos 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1′-rac-glicerol) (POPG), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DPhPG) y 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhPE) se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) y utilizado sin ninguna purificación. Todos los demás reactivos se utilizaron como grado analítico o mejor. Los aislados bacterianos provienen de una colección mantenida por UKHSA14.

La actividad antibacteriana de los péptidos se evaluó mediante un ensayo de microdilución en caldo doble modificado con CIM modales generadas a partir de al menos tres experimentos biológicos replicados37. El método siguió en términos generales la metodología EUCAST, con Mueller Hinton sin ajuste de cationes reemplazando a Mueller Hinton ajustado con cationes. Los péptidos y los antibióticos se diluyeron al doble en medios en una placa de 96 pocillos. Luego se agregaron bacterias, retrodiluidas de un cultivo nocturno, a una concentración inicial de 5 x 105 UFC/ml. Las placas se incubaron, de forma estática a 37 °C, durante 20 h y se determinó la DO600 utilizando un lector de placas Clariostar (BMG Labtech). La CIM se definió como la concentración más baja en la que el crecimiento fue <0,1 por encima de la absorbancia de fondo.

El método de Tekin et al. fueron seguidos en las mismas condiciones son los PRM19. Brevemente, se realizó un ensayo de actividad antibacteriana por triplicado como anteriormente, y el punto final de crecimiento se usó para calcular la concentración de péptido que inhibía el 10% del crecimiento. Se añadieron péptidos a estas concentraciones a los pocillos de una placa de 96 pocillos, solos y en combinaciones de 2, 3, 4, 5 o los 6 péptidos hasta un total acumulativo de 100 µl. Luego se agregaron 100 µl de bacterias a una concentración inicial de 5 × 105 UFC/ml y la placa se incubó estáticamente a 37 °C durante 20 h. La DO600 se determinó utilizando un lector de placas Clariostar (BMG Labtech). Se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento para cada combinación en comparación con un control no tratado. La sinergia de independencia neta de Bliss se calculó según Tekin et al. restando la inhibición aditiva de los péptidos individuales de la inhibición total de la combinación.

Se probaron combinaciones de péptidos por pares siguiendo un método de MIC ajustado de la siguiente manera. Se agregaron combinaciones de 2 péptidos, con cada compuesto en su concentración de CIM, a la primera fila de una placa de 96 pocillos y se diluyeron en la placa en una dilución en serie al doble. Se agregaron bacterias como en un ensayo de MIC estándar, la placa se incubó en las mismas condiciones y la MIC de la combinación se definió de la misma manera. La concentración inhibidora fraccionada se calculó a partir de la CIM combinada para dos repeticiones independientes y se presentó como el promedio +/- error estándar de la media. La FIC se calcula como (MIC del compuesto A en combinación con B/MIC del compuesto A solo) + (MIC del compuesto B en combinación con A/MIC del compuesto B solo). Cuando la MIC era >128 µg/ml, se usó una MIC supuesta de 256 µg/ml para calcular la FIC y se añadió una concentración superior de 128 µg/ml a la combinación. Los valores de FIC ≤0,5 se consideraron fuertemente sinérgicos y, de acuerdo con una reevaluación reciente de FIC que enfatiza la importancia de medir también la MIC en la misma placa de microarrays, los valores de 0,5–<1 fueron débilmente sinérgicos18.

La sinergia se midió utilizando ensayos Chequerboard de microdilución estándar en las mismas condiciones que las MIC con RPMI140 + FBS al 5 % utilizadas junto con MHB18. Se prepararon series de diluciones dobles de cada péptido o antibiótico en placas de 96 pocillos separadas y luego se combinaron en una antes de la adición de bacterias. La interfaz de crecimiento/no crecimiento se determinó usando la misma definición que la MIC. La concentración inhibidora fraccionada se calculó a partir del pocillo más sinérgico de la placa para tres repeticiones independientes y se presentó como se indicó anteriormente. Las CIM se determinaron en las mismas placas que las FIC para aumentar la reproducibilidad.

Se realizaron ensayos farmacodinámicos in vitro con S. aureus 15 resistente a meticilina epidémica (EMRSA-15 NCTC 13616) cultivado en RPMI140 + 5% FBS o en caldo Mueller-Hinton, y A. baumannii ATCC 17978 o AYE cultivado en caldo Mueller Hinton (MHB). ). Se utilizó MHB ajustado por cationes (CA-MHB) al probar la daptomicina debido a su requerimiento de iones Ca2+ para su actividad. Las bacterias se cultivaron durante la noche en 10 ml de MHB o RPMI + FBS al 5 % a 37 °C y se diluyeron justo antes de la inoculación en placa hasta una DO600 de 0,002. Se prepararon soluciones madre de WF1a, WF2, WF3, WF4, D-WF1a, D-WF2, tobramicina, gentamicina, daptomicina, imipenem, meropenem o ciprofloxacina en agua Milli-Q estéril a una concentración de 200 × MIC. La daptomicina se preparó en metanol a una concentración de 2000 × MIC y se diluyó con medio a 200 × MIC en el primer pocillo. Se realizó una serie de diluciones en la fila superior de una placa de polipropileno de 96 pocillos desde 200 × o 100 × MIC (consulte la Tabla complementaria 5 para conocer las concentraciones máximas para cada condición) hasta 0,2 × MIC en un volumen de 100 µl, a los cuales se les agregaron 100 µl. de la suspensión bacteriana se añadió para tener un total de 1 × 106 unidades formadoras de colonias (UFC) en fase logarítmica en 200 μl. La primera muestra t = 0 se tomó <30 s después de la adición de bacterias a la placa y posteriormente se tomaron más muestras a intervalos apropiados. Se tomaron muestras de bacterias expuestas a péptidos cada 20 minutos durante 120 minutos debido a la muerte rápida, mientras que de bacterias expuestas a tobramicina, gentamicina, daptomicina, imipenem, meropenem y ciprofloxacina se tomaron muestras cada hora durante 6 h. Se extrajo un volumen de 15 µl de cada pocillo y, siguiendo el método de placa de gota para enumerar bacterias38, se diluyó 1:1000 en solución salina tamponada con fosfato y se sembró en placas de agar MH o agar CA-MH. Las placas se incubaron a 37 °C durante la noche para el recuento de UFC. Los datos de UFC se transformaron log10 y la tasa de crecimiento neto bacteriano se determinó a partir del aumento o disminución de UFC durante el tiempo de exposición a los péptidos o antibióticos como el coeficiente de una regresión lineal de log10 UFC en función del tiempo. La intercepción de la regresión se fijó forzando las líneas de regresión a través de la primera medición de UFC (0 min) a una concentración antimicrobiana determinada. La función farmacodinámica según Regoes et al. describe la relación entre la tasa neta de crecimiento bacteriano ψ y la concentración de un antimicrobiano (a)39:

Ajustar esta función a las tasas netas de crecimiento bacteriano en OriginPro 2020 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) genera los parámetros ψmin y ψmax, respectivamente, la tasa de crecimiento mínima y máxima, zMIC, la concentración inhibidora mínima farmacodinámica, y κ, una medida de la cooperatividad. Los parámetros promedio obtenidos de ajustes de tres o más experimentos repetidos de forma independiente se compararon mediante ANOVA unidireccional con una prueba post hoc de Tukey. Dado que los datos de las UFC se transforman en log10, las tasas de crecimiento neto se informan posteriormente con tres cifras significativas.

Se probaron las actividades antimicrobianas de los WF AMP y los antibióticos clínicamente relevantes gentamicina, ciprofloxacina, imipenem y meropenem contra una infección por quemadura con A. baumannii ATCC 17978 en larvas de Galleria mellonella. Antes de su uso, se descontaminó la superficie de G. mellonella mediante inmersión en etanol al 50% durante 20 segundos y se dejó secar. Todos los ensayos se realizaron en tres ocasiones distintas utilizando un tamaño de grupo de 10 larvas; Las larvas se mantuvieron en placas de Petri separadas y en la oscuridad en una incubadora estática a 37 °C durante la duración del experimento. Se prepararon placas de agar frescas de A. baumannii ATCC 17978 inmediatamente antes del experimento. Las larvas se quemaron utilizando la cabeza plana de un clavo que se calentó en la llama de un mechero Bunsen azul hasta que estaba al rojo vivo, se enfrió durante 15 s y se aplicó superficialmente durante 2 s para generar una quemadura de 2 mm2. Las larvas se infectaron con una única colonia de A. baumannii ATCC 17978 aplicada directamente en el lugar de la quema. El tratamiento se aplicó tópicamente 1 h después de la infección en un volumen de 5 µl o solución salina tamponada con fosfato estéril como control. La supervivencia se controló durante 96 h.

Las muestras de RMN consistieron en una solución peptídica 0,5 mM que también contenía dodecilsulfato de sodio deuterado (SDS-d25) 50 mM con tampón Tris(hidroximetil-d3)-amino-d2-metano 5 mM a pH 7. D2O al 10 % que contenía ácido trimetilsilil propanoico. (TSP) se agregó para la señal de bloqueo y como referencia de cambio químico interno. La temperatura se mantuvo constante a 298 K durante los experimentos de RMN. Los espectros de RMN se adquirieron en un espectrómetro Bruker Avance de 600 MHz (WF1a únicamente a 700 MHz) (Bruker, Coventry, Reino Unido) equipado con una criosonda. Se utilizaron secuencias de pulsos estándar Bruker TOCSY y NOESY, con supresión de agua mediante una secuencia WATERGATE 3-9-19 con gradientes (mlevgpph19 y noesygpph19). El pulso 1H de 90 grados se calibró a 37,04 kHz. El tiempo de mezcla TOCSY fue de 80 ms y el tiempo de mezcla para los espectros NOESY se estableció en 200 ms. El retraso de la relajación fue de 1 s. Se registraron 2048 puntos de datos en la dimensión directa y 512 puntos de datos en la dimensión indirecta. Los espectros se procesaron utilizando Bruker TOPSPIN. La caída de inducción libre se multiplicó por una función de ventana de seno2 desplazada. Después de la transformación de Fourier, los espectros se corrigieron de fase, se aplicó una corrección de referencia y los espectros se calibraron para la señal de TSP a 0 ppm.

Para las asignaciones y cálculo de estructuras se utilizó el software Dynamo40. Las interacciones NOE entre protones se utilizaron como restricciones de distancia en el cálculo de la estructura con el protocolo de recocido en Dynamo. En este caso solo se utilizaron NOE inequívocos, después de clasificarlos como fuertes, medios y débiles en base a su intensidad relativa en los espectros NOESY. Utilizando esta clasificación, se aplicaron límites superiores de 0,27, 0,33 y 0,50 nm, respectivamente, como limitación de la correspondiente distancia entre protones. Se calcularon mil estructuras y se seleccionaron, alinearon y se seleccionaron los 100 confórmeros con la energía potencial más baja, y se calculó la desviación cuadrática media (RMSD) de los átomos pesados ​​de la columna vertebral con respecto a su estructura promedio. Las moléculas de disolvente no se incluyeron en los cálculos. Las coordenadas estructurales se depositaron en el Protein Data Bank (www.rcsb.org); consulte la declaración de “Disponibilidad de datos”.

Las simulaciones se llevaron a cabo en las instalaciones de KCL Rosalind High Performance Computing (HPC) o en estaciones de trabajo Dell Precision quad core T3400 o T3500 equipadas con una fuente de alimentación (PSU) de 1 kW y dos tarjetas gráficas NVIDA PNY GeForce GTX570 o GTX580 y ocasionalmente el ARCHER. Supercomputadora Cray XC30 que utiliza Gromacs 2018 o 202041. El campo de fuerza totalmente atómico CHARMM36 se utilizó en todas las simulaciones42,43,44. Todas las membranas de este proyecto contenían un total de 512 lípidos, compuestos de POPE/POPG (75:25 mol:mol) o POPG. Se insertaron cuatro péptidos al menos a 30 Angstrom por encima de la bicapa lipídica en una posición y orientación aleatorias, con al menos 20 Angstrom de distancia. Las estructuras iniciales se tomaron del cálculo de RMN en micelas de SDS. Como anteriormente, los residuos de histidina fueron protonados14, pero los residuos de aspartato o glutamato quedaron en sus formas aniónicas. El sistema se solvató con agua TIP3P y se agregaron iones Na+ para neutralizarlo. La minimización de energía se llevó a cabo a 310 K con el termostato Nose-Hoover utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado hasta que la fuerza máxima fue inferior a 1000,0 kJ/ml/nm <4000 pasos). El equilibrio se llevó a cabo utilizando el conjunto NVT durante 100 ps y luego el conjunto NPT durante 1000 ps con restricciones de posición en los péptidos. Los ángulos de enlace que contienen hidrógeno se limitaron con el algoritmo LINCS. Las simulaciones finales se ejecutaron en el conjunto NPT utilizando intervalos de 2 fs, con trayectorias registradas cada 2 ps. Todas las simulaciones se ejecutaron por triplicado durante un total de 200 ns con péptidos insertados en diferentes posiciones y orientaciones, dando un total de aproximadamente 10,8 µs de simulación. Los ángulos de torsión son cantidades circulares y la media circular de los ángulos psi o phi se puede calcular de la siguiente manera:

De manera similar, la varianza circular asociada para los ángulos psi o phi se calcula de la siguiente manera:

Var (ψ) = 1 − Ámbar

siendo R dado por:

Los espectros CD de UV lejano de los péptidos unidos a pequeñas vesículas unilaminares (SUV) se obtuvieron utilizando un espectrómetro Chirascan Plus (Applied Photophysics, Leatherhead, Reino Unido) con muestras mantenidas a 310 K. Para preparar SUV, los polvos lipídicos se solubilizaron en cloroformo y se secaron. bajo evaporación del rotor. Para eliminar completamente el disolvente orgánico, las películas lipídicas se dejaron durante la noche al vacío y se hidrataron en tampón Tris 5 mM (pH 7,0). La suspensión de lípidos se sometió a 5 ciclos rápidos de congelación y descongelación para una mayor homogeneización de la muestra. Los SUV POPE/POPG (75:25, mol:mol) y POPG se obtuvieron sonicando la suspensión lipídica en Soniprep 150 (Measuring and Scientific Equipment, Londres, Reino Unido) durante 3 × 5 min con una amplitud de 6 micrones en presencia de hielo. para evitar la degradación de los lípidos. Los SUV se almacenaron a 4 °C y se utilizaron dentro de los 5 días posteriores a su preparación. Se registraron espectros CD de UV lejano de 260 a 190 nm. Se añadió suspensión de SUV a una cubeta de 0,5 mm a una concentración final de 3,0 mM y luego se agregaron unos pocos µl de una solución peptídica concentrada y se mezclaron completamente para dar una concentración final de péptido de 15 µM. Se utilizaron las mismas condiciones experimentales para investigar la estructura secundaria del péptido en micelas de SDS, mientras que la concentración de micelas de SDS fue de 5 mM con péptido 50 µM. En el procesamiento, se restó un espectro de la suspensión de lípidos libre de péptidos o la solución de SDS y se aplicó el suavizado de Savitsky-Golay con un ancho de convolución de 5 puntos.

Como en nuestro trabajo anterior18, aquí se utilizan lípidos con cadenas de difitanoilo para formar vesículas unilaminares gigantes (GUV). Se prepararon GUV compuestos de DPhPE/DPhPG (60:40, mol:mol) y DPhPG en presencia de sorbitol 1 M mediante el método de electroformación en una cámara de vidrio recubierta de óxido de indio y estaño (ITO) conectada a la configuración Nanion Vesicle Prep Pro. (Nanion Technologies GmbH, Munich, Alemania) utilizando un voltaje de CA pico a pico de 3 V, a una frecuencia de 5 Hz, durante 120 y 140 min, respectivamente, a 37 °C. Se formaron bicapas añadiendo la solución GUV a un tampón que contenía KCl 250 mM, MgCl2 50 mM y Hepes 10 mM (pH 7,00) en una abertura en un chip de borosilicato (Port-a-Patch®; Nanion Technologies) y aplicando 70–90 mbar de presión negativa, lo que da como resultado una membrana libre de disolventes con una resistencia en el rango de GΩ. Después de la formación, se añadió una pequeña cantidad de solución madre de péptido (en agua) a 50 µl de solución tampón para obtener su concentración activa. Todos los experimentos se llevaron a cabo con un potencial de retención positivo de 50 mV. La concentración activa, la concentración a la que el péptido mostró por primera vez actividad de membrana, para cada péptido se obtuvo mediante una titulación realizada en las mismas condiciones. Para todos los experimentos se realizó un mínimo de 6 repeticiones concordantes. Las trazas de corriente se registraron a una frecuencia de muestreo de 50 kHz utilizando un amplificador EPC-10 de HEKA Elektronik (Lambrecht, Alemania). El sistema fue controlado por computadora mediante el software PatchControl ™ (Nanion) y GePulse (Michael Pusch, Génova, Italia). Los datos se filtraron utilizando el filtro Bessel incorporado del EPC-10 a una frecuencia de corte de 10 kHz. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente. El análisis de los datos se realizó con el paquete de software pClamp 10 (Axon Instruments).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

La información complementaria incluye un análisis más extenso de los datos de simulación MD, experimentos de dicroísmo circular y análisis adicionales de los datos de la abrazadera de parche. Las coordenadas estructurales se depositaron en el Protein Data Bank (www.rcsb.org) y el Biological Magnetic Resonance Bank (BMRB; www.bmrb.wisc.edu) con los códigos de acceso 6S2D, 6RYQ, 6RY9, 6RZ1 y 6RZC (PDB) y 34416. , 34411, 34410, 34412 y 34413 (BMRB) para WF1, WF1a, WF1a-1, WF3 y WF4, respectivamente. Además de las coordenadas estructurales, los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Descargar referencias

Los experimentos de RMN descritos en este artículo se llevaron a cabo utilizando las instalaciones del Centro de Espectroscopía Biomolecular del King's College de Londres y con el apoyo del Dr. Andrew Atkinson. Los instrumentos del Rey se adquirieron con una subvención para equipos multiusuario del Wellcome Trust y una subvención para infraestructura de la British Heart Foundation. Los autores reconocen el uso de las instalaciones informáticas de investigación del King's College London, Rosalind (https://rosalind.kcl.ac.uk), que se ofrece en asociación con los centros de investigación biomédica del Instituto Nacional de Investigación en Salud (NIHR) en el sur de Londres. & Maudsley y Guy's & St. Thomas' NHS Foundation Trusts, y parcialmente financiado por subvenciones de bienes de capital de Maudsley Charity (premio 980) y Guy's & St. Thomas' Charity (TR130505). Las opiniones expresadas son las de los autores y no necesariamente las del NHS, el NIHR, el King's College London o el Departamento de Salud y Atención Social. Este trabajo utilizó el Servicio Nacional de Supercomputación ARCHER del Reino Unido (http://www.archer.ac.uk). CDL reconoce el estimulante entorno de investigación proporcionado por el Centro EPSRC para la formación doctoral en enfoques interdisciplinarios de sistemas sin equilibrio (CANES, EP/L015854/1). PMF recibió el apoyo de una beca para escuelas de salud financiada por EPSRC (EP/M50788X/1). AJM recibió financiación de una subvención de Transferencia de Habilidades y Conocimientos del NC3R (NC/T001240/1). JR cuenta con el apoyo de una beca BBSRC LIDo iCASE (2547373). CH y M. Clifford recibieron financiación del fondo PHE Pipeline y, más tarde, del proyecto PHE Grant in Aid 109505.

Instituto de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Cáncer y Ciencias Farmacéuticas, King's College London, Franklin-Wilkins Building, 150 Stamford Street, Londres, SE1 9NH, Reino Unido

Maria Clarke, Philip M. Ferguson, Georgia Manzo, Bhumil Mistry, Bingkun Yue, Janis Romanopoulos, J. Mark Sutton y A. James Mason

Grupo de Desarrollo Tecnológico, Agencia de Seguridad Sanitaria del Reino Unido, Investigación y Evaluación, Porton Down, Salisbury, SP4 0JG, Reino Unido

Charlotte K. Hind, Melanie Clifford y J. Mark Sutton

Centro de Espectroscopía Biomolecular y División Randall de Biofísica Celular y Molecular, King's College London, New Hunt's House, Londres, SE1 1UL, Reino Unido

Tam T. Bui y Alex F. Drake

Departamento de Física, King's College London, Londres, WC2R 2LS, Reino Unido

Christian D. Lorenz

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AJM escribió el texto principal del manuscrito, preparó todas las figuras y, junto con JMS y CDL, diseñó la investigación. M. Clarke realizó estudios estructurales de RMN, estudios de patch-clamp, experimentos de CD, experimentos de Galleria mellonella y, junto con PMF, CDL y BY, realizó y/o analizó datos de simulación atomística. Con la ayuda de BM, M Clarke también realizó experimentos de EP in vitro. GM diseñó estudios de parcheo. TTB y AFD ayudaron en el análisis e interpretación de las mediciones de CD. CKH, M. Clifford, M. Clarke, JR y JMS realizaron y/o diseñaron ensayos antibacterianos in vitro. Todos los autores aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Christian D. Lorenz, J. Mark Sutton o A. James Mason.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Clarke, M., Hind, CK, Ferguson, PM et al. Sinergia entre los péptidos antimicrobianos de la platija de invierno. npj Antimicrob Resist 1, 8 (2023). https://doi.org/10.1038/s44259-023-00010-7

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Recibido: 21 de marzo de 2023

Aceptado: 23 de junio de 2023

Publicado: 10 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s44259-023-00010-7

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