Evidencia de selección natural en las mitocondrias.

Jul 17, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 14110 (2023) Citar este artículo

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Los péptidos derivados de mitocondrias están codificados por el ADN mitocondrial pero tienen actividad biológica fuera de las mitocondrias. Ocho de ellos están codificados por secuencias dentro de los genes ribosómicos mitocondriales 12S y 16S: humanina, MOTS-c y los seis péptidos SHLP, SHLP1-SHLP6. Estos péptidos tienen diversos efectos en cultivos celulares y modelos animales, afectando la neuroprotección, la sensibilidad a la insulina y la apoptosis, y algunos se secretan y potencialmente tienen funciones de señalización extracelular. Sin embargo, a excepción de la humanina, se desconoce su importancia en la función celular normal. Para evaluar su importancia, se han analizado sus secuencias codificantes en vertebrados para detectar sesgos de codones sinónimos. Debido a que se encuentran en genes de ARN, tal sesgo sólo debería ocurrir si sus aminoácidos se han conservado para mantener la función biológica. Humanin y SHLP6 muestran un fuerte sesgo de codones sinónimos y conservación de secuencia. Por el contrario, SHLP1, SHLP2, SHLP3 y SHLP5 no muestran un sesgo significativo y están mal conservados. MOTS-c y SHLP4 también carecen de un sesgo significativo, pero contienen regiones N-terminales altamente conservadas y no se puede descartar su importancia biológica. Se descubrió una posible secuencia peptídica adicional derivada de mitocondrias que precede a SHLP2, denominada SHLP2b, que también contiene una región N-terminal altamente conservada con sesgo de codones sinónimo.

En este artículo evaluamos la noción de que los péptidos codificados por marcos de lectura abiertos (ORF) cortos necesariamente tienen funciones biológicas importantes1. En particular, nos centramos en los péptidos derivados de mitocondrias (MDP), de los cuales la humanina es el más conocido. Cuando se descubrió la humanina hace más de veinte años, fue la primera de su tipo, un péptido codificado por el ADN mitocondrial pero con actividad biológica fuera de la mitocondria. Se encontró en una prueba de péptidos neuroprotectores utilizando una biblioteca de ADNc creada a partir de neuronas supervivientes de un paciente con enfermedad de Alzheimer2. Antes de esto, se pensaba que el genoma mitocondrial solo codificaba 13 proteínas, todas las cuales permanecen dentro de la mitocondria. Sin embargo, se descubrió que la humanina inhibe la apoptosis, interactuando con las proteínas proapoptosis BAX, BIM, BID e IGFBP-3 en el citosol celular5,6,7,8. Además, se detectó humanina secretada en medio de cultivo celular y se descubrió que la humanina extracelular interactúa con las proteínas receptoras de la superficie celular FPRL-1 y CNTFR/WSX-1/gp130, que participan en el metabolismo y la señalización de la inflamación2,9,10. Curiosamente, su propiedad antiapoptótica también puede ser potencialmente perjudicial, ya que más allá de cierto umbral, la inhibición de la muerte celular puede promover el crecimiento tumoral en el cáncer11,12,13.

Humanin es único en otro sentido; está codificado por un gen anidado y superpuesto dentro de un gen de ARN. La secuencia que codifica la humanina se encuentra dentro del MT-RNR2, el gen de la subunidad 16S del ribosoma mitocondrial. Búsquedas recientes de los genes de ARN mitocondrial 16S y 12S han identificado siete MDP adicionales con posible actividad biológica. Estos son los seis SHLP (pequeños péptidos similares a la humanina), SHLP1-SHLP6, que se encuentran dentro de MT-RNR2, y MOTS-c (marco de lectura abierto mitocondrial de los doce S rRNA tipo-c), dentro del gen mitocondrial del ARN 12S. MT-RNR114,15. En la Fig. 1 se muestra un diagrama que muestra las ubicaciones de sus ORF dentro de los genes de ARN 16S y 12S. Se han observado varias actividades biológicas potenciales para los péptidos SHLP, incluida la mejora de la supervivencia celular por SHLP2 y SHLP3, la proliferación celular por SHLP4 y inducción de apoptosis por SHLP614. La producción de MOTS-c aumenta con el ejercicio, y el tratamiento con péptidos exógenos confiere muchos de los mismos beneficios que el ejercicio en modelos celulares y animales, incluida la mejora de la sensibilidad a la insulina15,16.

Ubicación de MDP en el ADNmt. Se indican las ubicaciones de las secuencias codificantes de MDP en los genes de ARN 16S y 12S (verde), con números que indican los péptidos SHLP, SHLP1-SHLP6 y humanina (HN) y MOTS-c. Las flechas indican la codificación por la cadena H del ADNmt (apunta hacia la izquierda) o la cadena L (apunta hacia la derecha). A continuación, se muestra un diagrama del ADNmt circular completo para comparar. Las secuencias de ARNt están en verde claro, el bucle D en rojo y los genes de proteínas en tonos de azul y violeta.

Para demostrar que un péptido es biológicamente importante, se puede demostrar que reducir su cantidad provoca una disfunción en la célula. Si bien actualmente no hay forma de eliminar los ORF mitocondriales, se pueden eliminar con ARNip (pequeño ARN de interferencia). Esto se ha hecho con la humanina, donde la caída redujo sus efectos antiapoptóticos y neuroprotectores5,17. Sin embargo, estos resultados no se han obtenido para los otros MPD. También se puede mostrar la importancia de un péptido mediante una prueba más sencilla que se basa en la evolución. La selección natural conservará los aminoácidos importantes para la función del péptido, por lo que se puede buscar la conservación de la secuencia entre especies. Desafortunadamente, debido a que las secuencias codificantes de los MDP se encuentran dentro de genes ribosómicos, la conservación de la secuencia por sí sola es insuficiente ya que podría reflejar la importancia de las bases de ARN correspondientes para la función de los ribosomas. Un enfoque complementario es buscar codones sinónimos en las secuencias codificantes de péptidos. Al igual que la conservación de la secuencia de aminoácidos, el sesgo de codones sinónimos es evidencia de una selección natural purificadora o negativa que ha estado "eliminando" mutaciones de aminoácidos no sinónimos a lo largo de la evolución. Por otro lado, para las regiones de los genes de ARN que no codifican péptidos, no debería haber sesgo. Por lo tanto, en este estudio, además de buscar la conservación de la secuencia, examinamos el sesgo de codones sinónimos en las secuencias codificantes de MDP. Al hacerlo, no sólo determinamos qué MDP se han conservado mediante la evolución, sino que también identificamos características compartidas que ofrecen pistas sobre sus funciones biológicas.

La Figura 2 muestra los logotipos de secuencia de aminoácidos y bases de consenso para las alineaciones de humanina de primates, mamíferos y vertebrados, con los valores fsyn correspondientes a continuación. Se resaltan las posiciones de aminoácidos con fsyn ≥ 0,5, es decir, con mutaciones sinónimas iguales o más que mutaciones no sinónimas. En la figura complementaria S1 se proporcionan detalles adicionales sobre el número de mutaciones y la conservación de la secuencia. La Figura 2 y las figuras siguientes muestran los resultados utilizando el código de ADN estándar. Los resultados que utilizan el código del ADN mitocondrial de vertebrados también se incluyen en la figura S1, con la única diferencia importante de que el codón en la posición 22 se convierte en un codón de parada, produciendo un péptido de 21 aminoácidos en lugar de 24. Una característica curiosa de las secuencias de humanina es que El codón de inicio metionina no está particularmente bien conservado. Las mutaciones del codón de inicio ocurren en todas las ramas de los vertebrados con una tasa de conservación general del 79%, que oscila entre el 96% en aves y el 46% en reptiles. El codón de parada en la posición 25 está aún peor conservado, con una conservación global del 58%.

Sesgo de codones sinónimo en humanina. (A) Secuencia de humanina en humanos. Logotipos de secuencia de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos con el sesgo de codón sinónimo fsyn a continuación en (B) primates (número de especies = 252), (C) mamíferos (número de especies = 148) y (D) vertebrados (número de especies = 359). Las alturas de las letras de las bases y los aminoácidos indican qué tan conservadas están entre especies. Las bases invariantes y los aminoácidos con codones invariantes se indican con asteriscos. El símbolo "X" significa codón de parada. Los valores de fsyn ≥ 0,5 están resaltados en rojo. Debido a que la metionina tiene un solo codón en el código de ADN estándar, no tiene valor fsyn. El código de color de los aminoácidos es hidrófobo (negro), ácido (rojo), básico (azul) e hidrófilo neutro (verde para residuos que contienen glicina e hidroxilo y magenta para los que contienen amida).

Los resultados para los vertebrados muestran dos regiones de bases altamente conservadas o invariantes, correspondientes a los codones de C8, L9 y E15, I16. Esta conservación podría deberse a que estas bases son críticas para la función de los ribosomas, o podría deberse a que los aminoácidos correspondientes son críticos para la función de la humanina, o una combinación de ambos. Por otro lado, hay aminoácidos altamente conservados con valores altos de fsyn en regiones con secuencias de bases menos conservadas, A2, L10, D17, L18 y V20, lo que sugiere que si bien estos aminoácidos son importantes para la función de la humanina, las bases correspondientes son menos importante para la función de los ribosomas. La región C-terminal tiene residuos altamente conservados en los mamíferos, pero muestra más variación en los no mamíferos. Especialmente interesante es la posición 22, que en los mamíferos casi siempre es arginina, pero en los no mamíferos suele ser lisina, lo que sugiere que una carga positiva en esta posición es importante para la función o el procesamiento de los seres humanos. Algunos aminoácidos tienen valores altos de fsyn en primates, F6 y R23, pero no en otros vertebrados, y viceversa, G5 y D17. Esto podría reflejar cierta especialización de funciones que involucran aquellos residuos presentes en una rama de los vertebrados pero ausentes en otras, o los altos valores de fsyn podrían deberse al azar. Se estima empíricamente que la probabilidad de que un fsyn > 0,5 ocurra por casualidad está en el rango de 0,035 a 0,065, como se describe en una sección posterior que examina la significación estadística de los análisis de MDP (consulte Análisis estadístico).

La Figura 3 muestra los logotipos de secuencia de aminoácidos y bases de consenso para las alineaciones MOTS-c de primates, mamíferos y vertebrados, con los valores fsyn correspondientes a continuación. En la figura complementaria S2 se proporcionan detalles adicionales sobre el número de mutaciones, la conservación de la secuencia y las diferencias utilizando el código del ADN mitocondrial de los vertebrados. La característica más sorprendente de las alineaciones de MOTS-c es el pentapéptido MGYIF altamente conservado en el medio de la secuencia. La región N-terminal muestra sólo una conservación de secuencia moderada, y la región C-terminal muestra aún menos. A diferencia de la humanina, casi todos los valores de fsyn son pequeños, excepto G7 en la alineación de los mamíferos. Por lo tanto, MOTS-c completo no muestra evidencia convincente de selección natural en vertebrados. Sin embargo, dada la muy alta conservación del pentapéptido MGYIF con su alto valor fsyn para G7 en mamíferos, es posible que el pentapéptido sea biológicamente importante, al menos en mamíferos.

Sesgo de codones sinónimo en MOTS-c. (A) Secuencia MOTS-c en humanos. Logotipos de secuencia de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos con el sesgo de codón sinónimo fsyn a continuación en (B) primates (número de especies = 254), (C) mamíferos (número de especies = 178) y (D) vertebrados (número de especies = 348). Las alturas de las letras de las bases y los aminoácidos indican qué tan conservadas están entre especies. Las bases invariantes y los aminoácidos con codones invariantes se indican con asteriscos. El símbolo "X" significa codón de parada. Los valores de fsyn ≥ 0,5 están resaltados en rojo. Debido a que la metionina y el triptófano tienen un solo codón en el código de ADN estándar, no tienen valores fsyn. El código de color de los aminoácidos es hidrófobo (negro), ácido (rojo), básico (azul) e hidrófilo neutro (verde para residuos que contienen glicina e hidroxilo y magenta para los que contienen amida).

La Figura 4 muestra los logotipos de secuencia de aminoácidos y bases de consenso para primates para los péptidos SHLP1, SHLP3 y SHLP5, con los valores fsyn correspondientes a continuación. En la figura complementaria S3 se proporcionan detalles adicionales sobre el número de mutaciones, la conservación de la secuencia y las diferencias utilizando el código del ADN mitocondrial de los vertebrados. Ninguno de estos péptidos SHLP muestra evidencia convincente de selección natural en primates. Las posiciones resaltadas con valores altos de fsyn, uno por péptido, podrían deberse fácilmente al azar. Además, sus codones de inicio están poco conservados, 33% para SHLP1, 18% para SHLP3 y 30% para SHLP5, lo que argumenta además en contra de importantes funciones biológicas para estos péptidos. Para confirmar que SHLP1, SHLP3 y SHLP5 no están conservados en los vertebrados, las secuencias humanas se alinearon con 19 especies de vertebrados no primates (Tabla complementaria S37), lo que nuevamente muestra una conservación deficiente de la secuencia, especialmente con respecto a los codones de inicio. Debido a esto, no se realizaron análisis completos con alineamientos de secuencias múltiples de mamíferos y vertebrados. Además, cabe señalar que la mala conservación de la secuencia de bases de SHLP3 es algo engañosa; contiene dos regiones con inserciones/eliminaciones de longitud variable y, cuando se alinean permitiendo espacios, la conservación de la secuencia de bases mejora dramáticamente.

Sesgo de codones sinónimo en SHLP1, SHLP3 y SHLP5. (A) La secuencia SHLP1 humana encima de los logotipos de secuencia correspondientes de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos y los valores fsyn de sesgo de codón sinónimos a continuación en primates (número de especies = 217). (B) La secuencia SHLP3 humana encima de los logotipos de secuencia correspondientes de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos y los valores fsyn de sesgo de codón sinónimos a continuación en primates (número de especies = 221). (C) La secuencia SHLP5 humana encima de los logotipos de secuencia correspondientes de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos y los valores fsyn de sesgo de codón sinónimos a continuación en primates (número de especies = 216). Las alturas de las letras de las bases y los aminoácidos indican qué tan conservadas están entre especies. Las bases invariantes y los aminoácidos con codones invariantes se indican con asteriscos. El símbolo "X" significa codón de parada. Los valores de fsyn ≥ 0,5 están resaltados en rojo. Debido a que la metionina y el triptófano tienen un solo codón en el código de ADN estándar, no tienen valores fsyn. El código de color de los aminoácidos es hidrófobo (negro), ácido (rojo), básico (azul) e hidrófilo neutro (verde para residuos que contienen glicina e hidroxilo y magenta para los que contienen amida).

El análisis inicial de la alineación de la secuencia de SHLP2 reveló un grupo de codones con valores altos de fsyn que preceden a SHLP2 en el mismo marco de lectura abierto. Este grupo comienza con un codón de inicio ATG de metionina estándar en la mayoría de las especies de primates, y este nuevo péptido putativo se denomina SHLP2b. Debido a que se superponen, los logotipos de secuencia de aminoácidos y bases de consenso para SHLP2 y SHLP2b se muestran juntos en la Fig. 5, con los valores fsyn correspondientes a continuación. En la figura complementaria S4 se proporcionan detalles adicionales sobre el número de mutaciones, la conservación de la secuencia y las diferencias utilizando el código del ADN mitocondrial de los vertebrados. Los humanos tienen el codón de inicio alternativo GTG al inicio del supuesto péptido SHLP2b, al igual que la mayoría de los vertebrados que no son primates18. En humanos, el codón de parada para SHLP2b sería el mismo que para SHLP2, pero para los primates en general, el codón de parada estaría más a menudo en la posición 24 en la Fig. 5, produciendo un péptido de 23 residuos de longitud.

Sesgo de codones sinónimo en SHLP2 y SHLP2b. (A) Secuencias de SHLP2b (línea azul) y SHLP2 (línea verde) en humanos. Logotipos de secuencia de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos con el sesgo de codón sinónimo fsyn a continuación en (B) primates (número de especies = 219), (C) mamíferos (número de especies = 174) y (D) vertebrados (número de especies = 369). Las alturas de las letras de las bases y los aminoácidos indican qué tan conservadas están entre especies. Las bases invariantes se indican con asteriscos. El símbolo "X" significa codón de parada. Los valores de fsyn ≥ 0,5 están resaltados en rojo. Debido a que la metionina tiene un solo codón en el código de ADN estándar, no tiene valor fsyn. El código de color de los aminoácidos es hidrófobo (negro), ácido (rojo), básico (azul) e hidrófilo neutro (verde para residuos que contienen glicina e hidroxilo y magenta para los que contienen amida).

En primates, SHLP2 tiene solo un aminoácido, en la posición 29 de la Fig. 5, con un valor de fsyn superior a 0,5, pero otros dos, en las posiciones 15 y 16, tienen valores cercanos a 0,5. Debido a que la elección de 0,5 como umbral fsyn fue algo arbitraria, SHLP2 también se analizó a nivel de mamíferos y vertebrados; sin embargo, los valores de fsyn fueron aún más bajos. Por lo tanto, SHLP2 no muestra evidencia convincente de selección purificadora. Por el contrario, el grupo de codones conservados de alto valor fsyn al comienzo de SHLP2b persiste incluso a nivel de vertebrados, lo que sugiere que el supuesto péptido SHLP2b podría ser biológicamente importante. Tenga en cuenta que, al igual que SHLP3, SHLP2 contiene una región con inserciones/eliminaciones poco después del codón de inicio, lo que hace que la conservación de la secuencia de bases parezca engañosamente baja en la figura.

La Figura 6 muestra los logotipos de secuencia de aminoácidos y bases de consenso para las alineaciones de SHLP4 de primates, mamíferos y vertebrados, con los valores fsyn correspondientes a continuación. En la figura complementaria S5 se proporcionan detalles adicionales sobre el número de mutaciones, la conservación de la secuencia y las diferencias utilizando el código del ADN mitocondrial de los vertebrados. En los mamíferos, incluidos los primates, la región N-terminal está altamente conservada, con muchas bases invariantes y está flanqueada por aminoácidos, L2 y R11, por ejemplo, con valores altos de fsyn. Los resultados sugieren que la región N-terminal de SHLP4, residuos 1 a 12, podría haber sufrido una selección purificadora en mamíferos. Por el contrario, el resto del péptido está peor conservado. Las alineaciones de SHLP4 tienen una región de inserciones/deleciones en el medio de la secuencia, lo que explica la peor conservación de la secuencia. En los vertebrados no mamíferos, el codón de inicio no está bien conservado, pero M5 todavía está altamente conservado, y casi todas las mutaciones que ocurren son en el codón de inicio alternativo GTG. Los resultados que incluyen a todos los vertebrados no son tan convincentes como los de los mamíferos solos, pero no se puede descartar que los residuos 5 a 12 también hayan sufrido selección natural en los no mamíferos, con M5 como codón de inicio.

Sesgo de codones sinónimo en SHLP4. (A) Secuencia SHLP4 en humanos. Logotipos de secuencia de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos con el sesgo de codón sinónimo fsyn a continuación en (B) primates (número de especies = 215), (C) mamíferos (número de especies = 144) y (D) vertebrados (número de especies = 339). Las alturas de las letras de las bases y los aminoácidos indican qué tan conservadas están entre especies. Las bases invariantes y los aminoácidos con codones invariantes se indican con asteriscos. El símbolo "X" significa codón de parada. Los valores de fsyn ≥ 0,5 están resaltados en rojo. Debido a que la metionina tiene un solo codón en el código de ADN estándar, no tiene valor fsyn. El código de color de los aminoácidos es hidrófobo (negro), ácido (rojo), básico (azul) e hidrófilo neutro (verde para residuos que contienen glicina e hidroxilo y magenta para los que contienen amida).

La Figura 7 muestra los logotipos de secuencia de aminoácidos y bases de consenso para las alineaciones de SHLP6 de primates, mamíferos y vertebrados, con los valores fsyn correspondientes a continuación. En la figura complementaria S6 se proporcionan detalles adicionales sobre el número de mutaciones, la conservación de la secuencia y las diferencias utilizando el código del ADN mitocondrial de los vertebrados. SHLP6 tiene la secuencia más conservada de las MDP presentadas aquí y, a diferencia de las otras MDP, su codón de parada también está altamente conservado. Además, tiene varios residuos con alto valor de fsyn, por lo que los resultados sugieren que el péptido SHLP6 se ​​ha sometido a una selección purificadora.

Sesgo de codones sinónimo en SHLP6. (A) Secuencia SHLP6 en humanos. Logotipos de secuencia de las alineaciones de secuencias de bases y aminoácidos con el sesgo de codón sinónimo fsyn a continuación en (B) primates (número de especies = 242), (C) mamíferos (número de especies = 147) y (D) vertebrados (número de especies = 348). Las alturas de las letras de las bases y los aminoácidos indican qué tan conservadas están entre especies. Las bases invariantes y los aminoácidos con codones invariantes se indican con asteriscos. El símbolo "X" significa codón de parada. Los valores de fsyn ≥ 0,5 están resaltados en rojo. Debido a que la metionina tiene un solo codón en el código de ADN estándar, no tiene valor fsyn. El código de color de los aminoácidos es hidrófobo (negro), ácido (rojo), básico (azul) e hidrófilo neutro (verde para residuos que contienen glicina e hidroxilo y magenta para los que contienen amida).

Como ya se mencionó, los valores altos de fsyn pueden ocurrir por casualidad. Las secuencias de bases antes y después de los MDP se pueden utilizar para obtener una estimación empírica de la probabilidad inicial de que fsyn ≥ 0,5 ocurra por casualidad porque estas regiones se encuentran fuera de los ORF. En los alineamientos de secuencias, se incluyeron de 12 a 15 bases adicionales antes del codón de inicio y después del codón de parada, es decir, de 4 a 5 “codones” adicionales antes y después de cada péptido. Usando todos los MDP (para SHLP2/SHLP2b, solo se usan las bases antes de SHLP2b y después de SHLP2), se obtienen 77 "codones" adicionales, cinco de los cuales tienen valores fsyn ≥ 0,5, lo que da una estimación de probabilidad de 0,065. Este enfoque empírico no hace suposiciones sobre la neutralidad de mutaciones sinónimas, excepto que tienden a ocurrir con más frecuencia en regiones codificantes de péptidos conservadas que en regiones no codificantes. Debido a que SHLP1, SHLP3 y SHLP5 no muestran evidencia de selección natural, pueden usarse como verificación de coherencia. Cada uno de sus alineamientos de secuencia tiene solo una posición de aminoácido con fsyn ≥ 0,5. SHLP1 y SHLP5 tienen 24 aminoácidos de largo y SHLP3 tiene 38. Suponiendo que estos valores altos de fsyn se deben al azar, esto da una probabilidad promedio de 0,035, lo que sugiere que la probabilidad de 0,065 calculada con las secuencias antes y después de los MDP podría ser una sobreestimar. Las regiones utilizadas para calcular las dos estimaciones de probabilidad de referencia constan de 231 bases antes y después de los ORF de los MDP y 258 bases de SHLP1, 3 y 5, con un total de 489 bases. La longitud del gen 16S es de 1558 bases; por lo tanto, se ha muestreado una cantidad considerable de genes de ARN para obtener estimaciones de probabilidad de referencia. La variación de la conservación de la base, la presencia de inserciones/eliminaciones y la proximidad a los ORF podrían influir en la probabilidad de la línea de base y podrían explicar parte de la diferencia en los dos valores de la línea de base.

La Tabla 1 muestra los valores de p para cada alineación de secuencia utilizando la distribución binomial (Ec. 2), utilizando la probabilidad de referencia más estricta de 0,065. En otras palabras, al utilizar la estimación más alta de la probabilidad inicial, más residuos del MDP deben tener fsyn ≥ 0,5 para lograr significancia estadística. Sólo humanin y SHLP6 tienen valores de p inferiores a 0,05, el criterio habitual para considerar resultados estadísticamente sólidos, aunque SHLP4 está cerca. Tenga en cuenta que debido a que el valor 0,065 podría ser una sobreestimación de la probabilidad inicial, los valores p también podrían ser sobreestimaciones.

Nuestra evaluación del sesgo de codones sinónimos ha revelado que al menos dos MDP, humanina y SHLP6, muestran evidencia de selección natural, lo que implica que estos péptidos tienen funciones biológicas que han sido importantes durante el curso de la evolución de los vertebrados. Para la humana, el análisis de sesgo de codones sinónimos en vertebrados muestra evidencia sólida de selección purificadora (p <0,00063). Aunque la importancia de la humanina ya ha sido demostrada mediante experimentos de eliminación5,17, el resultado aquí sirve como algo más que un simple control positivo. En los seres humanos hay 13 homólogos de humanina en el genoma nuclear, de los cuales se ha confirmado que 10 se transcriben en diversos tejidos humanos19. Las secuencias de ADN nuclear que se originan en las mitocondrias se denominan numts (NUclear secuencia de origen MiTochondrial), y son comunes20. Por lo tanto, hipotéticamente, podría ser que la interferencia del ARN con las versiones nucleares, y no con la humanina mitocondrial, condujera a la disfunción en los experimentos de eliminación. Sin embargo, el resultado aquí sugiere que la versión mitocondrial de la humanina debe ser importante porque su secuencia peptídica se ha conservado a lo largo de la evolución de los vertebrados. Las versiones nucleares también podrían ser importantes y merecen más estudios, como el uso de técnicas CRISPR para alterar o eliminar los numts, y están en el horizonte métodos para introducir cambios de bases en genes mitocondriales21.

SHLP6 también muestra un sesgo de codones sinónimos (p <0,037 en vertebrados) que satisface el umbral de significancia de p <0,05. Quizás los resultados para SHLP4 (p <0,085 en mamíferos) y SHLP2b (p <0,19 en vertebrados) también reflejen una selección purificadora en sus regiones N-terminales altamente conservadas, pero hay muy pocos residuos con valores altos de fsyn para concluir esto estadísticamente. De manera similar, este análisis no puede descartar que el pentapéptido MGYIF altamente conservado en MOTS-c haya sido sometido a una selección purificadora para conservar su secuencia, pero la región es demasiado corta, y solo G7 tiene un alto valor de fsyn en mamíferos, para concluir que es significativo. Si bien este estudio no incluyó especies de invertebrados, las búsquedas de su ADN mitocondrial revelan secuencias homólogas a la humanina, SHLP6 y las regiones altamente conservadas de SHLP2b, SHLP4 y MOTS-c; por lo que los MDP no parecen ser exclusivos de los vertebrados (Figura complementaria S7).

Para los otros MDP: SHLP1, SHLP2, SHLP3 y SHLP5, los análisis muestran una conservación deficiente de la secuencia y no hay evidencia de sesgo de codones sinónimos. Los péptidos SHLP se identificaron por primera vez analizando el gen mitocondrial humano 16S MT-RNR2 para todos los ORF mayores o iguales a 20 aminoácidos de longitud, y es ciertamente posible que algunos de ellos surgieran por casualidad y no correspondieran a péptidos biológicamente importantes. Los autores no conocen informes que muestren actividades biológicas para SHLP1 y SHLP5. En el artículo original que los describe, se demostró que SHLP2 y SHLP3 son citoprotectores en dos modelos celulares, uno de origen humano y otro de murino. Curiosamente, los ratones (Mus musculus) no parecen tener homólogos de SHLP2 y SHLP3 (Fig. S8 suplementaria), por lo que, al menos para el modelo de células de ratón, el efecto citoprotector parecería fortuito. También es posible que SHLP1, SHLP2, SHLP3 y SHLP5 sean biológicamente importantes, pero surgieron demasiado recientemente en la evolución humana para que los análisis de codones sinónimos sean útiles.

Un análisis anterior de secuencias de MOTS-c en 14 especies (13 mamíferos y 1 pez) afirmó mostrar evidencia de selección "positiva"15. La selección positiva generalmente se refiere a una mutación beneficiosa introducida recientemente que se extiende por una población, y no está claro cómo debe interpretarse esto en todas las especies. Se afirmó que cuatro residuos mostraban selección positiva, Q4, E5, G7 e I9, y aquí se vuelven a analizar las secuencias de bases y los recuentos de codones para estos residuos para las 14 especies (Figura complementaria S9). Las bases del G7 son invariantes, mientras que las del Q4 son bastante variables. Los datos informados anteriormente mostraron proporciones de tasas de mutación no sinónimos y sinónimas, y proporciones mayores indican selección positiva, pero debido a que G7 es invariante, ambas tasas son cero y no está claro cómo se obtuvo la proporción informada. Es posible que los resultados sean artefactos debido al pequeño tamaño de la muestra. En cualquier caso, ninguno de los cuatro residuos tiene codones sinónimos en las 14 especies. Curiosamente, G7 tiene mutaciones sinónimas en los perezosos (Tabla complementaria S10), pero no se incluyeron perezosos en el análisis anterior.

Una característica que distingue a la humanina y al SHLP6 de los otros MDP del gen 16S MT-RNR2 es la dirección de su traducción, siendo la humanina y el SHLP6 codificados por la cadena H del ADNmt y los demás codificados por la cadena L ( Figura 1). MOTS-c también está codificado por la cadena H. Ambas cadenas de ADNmt se transcriben en ARN de forma policistrónica en casi toda su longitud. Sin embargo, no hay genes codificados por la región de la cadena L complementaria a los genes ribosómicos 16S y 12S, y la transcripción de la cadena L a menudo termina antes de llegar allí22. Esto significa que los MDP codificados en la cadena L se transcribirían menos que los codificados en la cadena H. Se han observado secuencias de ARN de MDP, incluidas secuencias con colas poliadeniladas en 3', en muestras de células y plasma utilizando sondas de secuencia de genes de humanina, MOTS-c y SHLP6 en experimentos de transferencia Northern y RT-PCR14,19,23,24, pero no se realizaron tales experimentos. Aún no se han informado resultados para los otros péptidos SHLP.

SHLP6 es único entre los MDP porque tanto sus codones de inicio como de parada son casi invariantes. La conservación relativamente pobre del codón de inicio de la humanina se ha informado antes25, y se confirma aquí, con sólo un 79% de conservación en todas las especies de vertebrados. Aún menos conservados están los otros codones de parada de MDP, con una tasa de conservación del 58% para la humanina y sólo del 17% en SHLP4, aunque SHLP4 tiene un codón de parada anterior en la posición 23 en el 71% de los mamíferos. El codón de arginina en la posición 22 de la humanina es un codón de parada en el código del ADN mitocondrial de los vertebrados y, en los mamíferos, es casi invariante con un valor fsyn de 0,86 para el codón de parada (Fig. S1 complementaria). Esto sugiere que la selección purificadora podría conservar el codón de parada, pero sólo si la humanina se traduce dentro de las mitocondrias. De hecho, un estudio observó la colocalización del péptido de humanina dentro de las mitocondrias en células sinoviales de pacientes con artritis reumatoide26, lo que coincide con que las mitocondrias son el sitio de expresión de la humanina; sin embargo, se necesitan más estudios para determinar si esto es cierto en condiciones no patológicas y en otros tipos de células.

Por otro lado, la humanina también se ha localizado fuera de las mitocondrias, así como extracelularmente, y se sabe que actúa tanto sobre las proteínas citosólicas como sobre las de la superficie celular5,6,7,9,10,27, por lo que la traducción citosólica también es una posibilidad. Si la humanina se traduce en el citosol, el péptido resultante puede variar mucho en longitud; por ejemplo, la humanina humana tiene 24 residuos, mientras que la humanina de rata, también conocida como rattin, tiene 38. Curiosamente, los residuos de humanina K21, R22 y R23, que están altamente conservados en los mamíferos, se parecen a los sitios de escisión dibásicos importantes en el procesamiento de muchos residuos secretados. hormonas28. Los residuos R10 y R11 de SHLP4, al final de su región N-terminal altamente conservada, también se parecen a un sitio de escisión dibásico, al igual que los residuos R13 y K14 de MOTS-c. El procesamiento proteolítico postraduccional podría ayudar a explicar por qué los codones de parada de MDP son tan variables; Mientras se conserve el sitio de escisión, la secuencia que pasa por él puede tener poca importancia. Sin embargo, actualmente no se sabe si el procesamiento proteolítico es importante para la función biológica del MDP. Tampoco se sabe si los MDP se traducen predominantemente en las mitocondrias o en el citosol. Un argumento a favor de la traducción citosólica es el hecho de que el segundo codón de MOTS-c es un codón de parada en el código del ADN mitocondrial, por lo que el MOTS-c de longitud completa debe traducirse en el citosol15. Sin embargo, el pentapéptido conservado MGYIF que comienza en la posición 6 de MOTS-c tiene su propio codón de inicio, por lo que podría traducirse dentro de las mitocondrias. Las cuestiones del procesamiento proteolítico y la traducción mitocondrial versus citosólica de los MDP claramente merecen más estudios.

Una preocupación con respecto al análisis de sesgo de codones sinónimos es que de los 55 residuos con fsyn ≥ 0,5 en las secuencias de MDP, 15 son residuos de leucina. La leucina es uno de los tres aminoácidos con seis codones en el código de ADN estándar, y es posible que la leucina esté sobrerrepresentada porque tiene una mayor probabilidad de que una mutación aleatoria sea sinónimo. Por otro lado, la serina también tiene seis codones, pero sólo uno de los residuos con fsyn ≥ 0,5 es serina, por lo que quizás el efecto sea pequeño. De hecho, la razón del mayor número de residuos de leucina podría ser biológica; los mutantes L9R y L10D de humanina no pueden ser secretados por las células29, y quizás los residuos de leucina podrían ser igualmente importantes para otras MDP.

Estas características compartidas, la longitud variable del péptido, los posibles sitios de escisión dibásica en humanina, SHLP4 y MOTS-c, y la alta frecuencia de leucina en humanina y SHLP4 son consistentes con el procesamiento y secreción de estos MDP, lo que implica funciones en la señalización intercelular. De hecho, ya se han detectado tanto humanina como MOTS-c fuera de las células2,15,29, aunque aún no hay informes sobre SHLP4. Por el contrario, el codón de parada bien conservado de SHLP6 con falta de un sitio de escisión dibásico aparente sugiere que su función podría ser intracelular. Curiosamente, si se traduce en las mitocondrias, la humanina también tiene un codón de parada altamente conservado, que reemplaza el sitio de escisión dibásico, lo que sugiere que la humanina podría desempeñar funciones duales, intracelular para el péptido expresado en las mitocondrias y extracelular cuando se expresa citosólicamente.

La búsqueda de MDP se ha centrado en péptidos más largos, al menos 20 residuos en el caso del gen mitocondrial 16S, pero los resultados presentados aquí implican que los péptidos más cortos también podrían ser importantes, especialmente si se produce procesamiento proteolítico. En particular, las regiones N-terminales de SHLP2b y SHLP4, y el pentapéptido MGYIF de MOTS-c están altamente conservadas e incluyen residuos con altos valores de fsyn, lo que sugiere que podrían tener funciones biológicas importantes. Hay muchos péptidos cortos biológicamente importantes: la hormona liberadora de gonadotropina con diez residuos, la oxitocina con nueve y las encefalinas con cinco, por nombrar algunos. No es necesario que los MDP aparezcan únicamente en genes de ARN, y el análisis de sesgo de codones sinónimos podría ampliarse para identificar MDP candidatos en todo el genoma mitocondrial. Un análisis sugirió que podría haber más de 80 ORF que conducen a MDP en el genoma mitocondrial30, y ya se ha identificado un MDP fuera de los genes ribosómicos, SHMOOSE,31, así como dos microproteínas, gau y Mtaltnd43,4. Además, al analizar regiones más grandes del genoma mitocondrial, incluidas más secuencias de bases no codificantes de péptidos, se puede mejorar el análisis estadístico.

Los péptidos pertenecientes a la familia de los MDP son fascinantes y ofrecen un nuevo paradigma para regular la señalización celular, el metabolismo, la inflamación y la muerte celular desde el genoma mitocondrial. Algunos de ellos, como la humanina y MOTS-c, se han estudiado más extensamente que otros por su impacto en las funciones celulares mencionadas anteriormente. Debido a sus efectos beneficiosos informados, la humanina y MOTS-c ya se están comercializando como terapias antienvejecimiento y mejoradores del rendimiento en humanos32, a pesar de las posibles propiedades de la humanina que promueven el cáncer. Esto destaca la necesidad de evaluar la validez potencial de estos péptidos a nivel del genoma. Un resultado de dicha evaluación es garantizar que la forma del péptido objetivo de la terapéutica sea la relevante. Por ejemplo, los resultados presentados aquí sugieren que el péptido MOTS-c, tal como se está estudiando (y comercializando) actualmente, podría no estar en su forma biológicamente más relevante. Además, identificar los residuos importantes y conservados ayudará a optimizar el rendimiento terapéutico de estos péptidos. Al rápido ritmo al que se están desarrollando estos péptidos para posibles tratamientos de enfermedades en el contexto de sus efectos potencialmente negativos, es prudente instar a que se sometan al riguroso escrutinio de la comunidad científica en general.

Las alineaciones de secuencia de las secuencias de bases que codifican las MDP se ensamblaron utilizando el nucleótido BLAST. Debido a que las secuencias corresponden a marcos de lectura abiertos, las alineaciones no contienen inserciones ni eliminaciones. Para los alineamientos de primates, se realizaron búsquedas exhaustivas, aunque no exhaustivas, de todas las especies de primates. Para los alineamientos de vertebrados, las secuencias se limitaron a especies cuyos genomas nucleares también habían sido secuenciados, lo que arrojó números de especies comparables a los alineamientos de primates. Las alineaciones de vertebrados resultantes consistieron en aproximadamente un 10% de primates, un 30% de otros mamíferos, un 20% de otros vertebrados terrestres y un 40% de peces. Para las alineaciones de mamíferos, las secuencias de no mamíferos se eliminaron de la lista de vertebrados. Para especies con más de una versión de la secuencia, presumiblemente debido a polimorfismos, se utilizó la versión más común. Para las especies que tenían una mutación de una base que de otro modo sería invariante, o una inserción/eliminación de cambio de marco que resultó en una mutación de aminoácidos que de otro modo serían invariantes, la búsqueda se amplió para incluir cualquier especie adicional con mutaciones en ese sitio. Si no se encontraban otras especies con una mutación en ese sitio, entonces se eliminaba la secuencia. Como consecuencia, el número de especies en los alineamientos es variable y los números específicos se dan en las leyendas de las figuras. Todas las alineaciones de secuencias también incluyeron 12 a 15 bases antes del codón de inicio y 12 a 15 bases después del codón de parada para proporcionar una comparación con regiones adyacentes, presumiblemente no codificantes de péptidos. Todas las alineaciones de secuencias se incluyen en la información complementaria (Tablas complementarias S1 a S36).

Para calcular la fracción de mutaciones sinónimas, fsyn, para cada posición de aminoácido, se tomó el codón más frecuente del aminoácido de consenso como codón “ancestral”, y el número total de mutaciones sinónimas de ese codón, nsyn, se divide por el número total de mutaciones, sinónimos más no sinónimos, nnon, en esa posición,

Por lo tanto, un resultado de 0,0 indica que todas las mutaciones no son sinónimas, 0,5 indica un número igual de mutaciones sinónimas y no sinónimas y 1,0 indica que todas las mutaciones son sinónimas para esa posición. A modo de comparación, la relación entre tasas sinónimos y no sinónimos, que es otra forma común de expresar el sesgo de codones sinónimos1, varía desde 0 para todas las mutaciones no sinónimas, 1 para un número igual de mutaciones sinónimas y no sinónimas, hasta +\ (\infty \) para todas las mutaciones sinónimas.

Los valores p de una cola para el número de apariciones de fsyn ≥ 0,5 en cada alineación de secuencia se calcularon utilizando la distribución binomial.

donde X es el número de residuos con fsyn ≥ 0,5, n es la longitud del péptido y p es la probabilidad aleatoria de fsyn ≥ 0,5. La probabilidad p se calculó utilizando regiones no codificantes de péptidos de las alineaciones de secuencias de vertebrados, excepto para SHLP1, SHLP3 y SHLP5, donde se usaron alineaciones de secuencias de primates. Las figuras del logo de secuencia de consenso se realizaron con Weblogo33.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Este trabajo fue financiado internamente por el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Laboratorio de Biofísica Estructural, Centro de Bioquímica y Biofísica, NHLBI, NIH, 50 South Drive, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

James M. Gruschus, Daniel L. Morris y Nico Tjandra

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JMG, DLM y NT contribuyeron al diseño del estudio. JMG realizó el análisis. JMG, DLM y NT contribuyeron a la preparación del manuscrito.

Correspondencia a James M. Gruschus.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Gruschus, JM, Morris, DL y Tjandra, N. Evidencia de selección natural en los péptidos derivados de mitocondrias humanina y SHLP6. Representante científico 13, 14110 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-41053-0

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Recibido: 08 de junio de 2023

Aceptado: 21 de agosto de 2023

Publicado: 29 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-41053-0

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